Summary
Subretinale Injektion hat weit in präklinischen Studien der Stammzell-Ersatz-Therapie bei altersbedingter Makuladegeneration angewendet worden. In diesem visualisierte Artikel beschreiben wir eine weniger riskante, reproduzierbar und präzise modifizierte subretinalen Injektionstechnik über den Trans-skleralen Ansatz um Zellen in Ratte Augen zu liefern.
Abstract
Degenerative Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration (AMD) sind die häufigste Ursache für irreversible Sehverlust weltweit. AMD zeichnet sich durch die Degeneration der Retina Pigment (RPE) Epithelzellen, die eine Monolage von Zellen funktionell unterstützen und anatomisch Umwickeln um die neuronale Netzhaut sind. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für die nicht-neovaskulären AMD (trockene AMD) nur verlangsamen das Fortschreiten der Erkrankung aber nicht wiederherstellen Vision, dass Studien, die darauf abzielen, neue therapeutische Strategien zu identifizieren. Ersetzen die degenerativen RPE-Zellen mit gesunden Zellen hält Versprechen, trockenen AMD in der Zukunft zu behandeln. Umfangreiche präklinische Studien der Stammzell-Ersatz-Therapien für AMD beinhalten die Transplantation von Stammzellen gewonnenen RPE-Zellen in den subretinalen Raum von Tiermodellen, in denen die subretinale Injektionstechnik angewendet wird. In dieser präklinischen tierexperimentellen Studien am häufigsten verwendete Ansatz ist durch die Trans-skleralen Route, die wird durch die fehlende direkte Visualisierung des Nadelendes erschwert und oft retinalen Schäden führen kann. Ein alternativer Ansatz durch den Glaskörper ermöglicht die direkte Beobachtung der Nadel Endlage, aber es trägt ein hohes Risiko der chirurgischen Verletzungen wie mehr Augengewebe gestört werden. Wir haben einen weniger riskant und reproduzierbare modifizierte Trans-skleralen Injektionsverfahren entwickelt, definierte Nadel Winkeln und tiefen erfolgreich und konsequent RPE-Zellen in der Ratte subretinalen Raum liefern und übermäßige retinalen Schäden zu vermeiden. Zellen, die auf diese Weise geliefert wurden zuvor nachgewiesen, für mindestens 2 Monate in das Royal College of Surgeons (RCS) Ratte wirksam sein. Diese Technik kann nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für die Lieferung von kleinen Molekülen oder Gentherapien verwendet werden.
Introduction
Die menschliche Netzhaut befindet sich auf der Rückseite des Auges-Funktionen als eine leichte sensorische Gewebe und spielt eine entscheidende Rolle in der Vision Wahrnehmung. Funktionsstörungen der retinalen Zellen oder Zelltod verursacht daher Sehstörungen oder dauerhafte Erblindung. Erkrankungen mit Degeneration oder Dysfunktion der Zellen in verschiedenen Schichten der Netzhaut sind als degenerative Netzhauterkrankungen, bekannt unter denen AMD die häufigste Form und die häufigste Ursache für irreversible Blindheit bei älteren Menschen in den entwickelten Ländern ist 1,2. Des pathologischen Prozesses von AMD ist verbunden mit "Drusen" Anhäufung zwischen der RPE-Schicht und die zugrunde liegenden Bruch-Membran, die wiederum RPE Unterstützung der Photorezeptor Physiologie, was zu neuronalen Retinaatrophie und Vision Verlust3beeinträchtigt, 4,5. Bisher gibt es keine Heilung für fortgeschrittene trocknen (nicht-neovaskulären) AMD. Die Entstehung der Stammzell-Therapie als ein neues Paradigma in der regenerativen Medizin bringt die Hoffnung die dysfunktionalen oder tot RPE-Zellen durch Stammzellen gewonnenen gesunde Zellen zu ersetzen. In der Tat umfangreiche präklinische Studien der Transplantation von Stammzellen (z.B. menschlicher embryonaler Stammzellen)-abgeleitete RPE-Zellen in RPE-degenerativen Tiermodelle wurden durchgeführt6,7, einige davon weit fortgeschritten sind, klinische Studien8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Vor kurzem, eine alternative Quelle für Stammzellen resident in der menschlichen RPE-Schicht, die menschlichen RPE Zellen (hRPESCs), wurde von unserem Labor identifiziert und ist derzeit in präklinischen Studien von hRPESC abgeleitet-RPE (hRPESC-RPE) Transplantation Zelltherapie für AMD verwendet wird 10 , 11 , 12 , 13.
Die subretinale Injektionstechnik wird in den präklinischen Studien erwähnt durch mehrere Gruppen, darunter unsere Gruppe angewendet. Es gibt zwei grundsätzliche Ansätze für die subretinale Injektion bei Tieren: Trans-Glaskörperblutung und Trans-skleralen. Die Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat den Vorteil des Chirurgen in der Lage, direkt am Ende der Nadel beobachten, wie das vordere Auge dringt, den gesamten Glaskörperblutung Hohlraum angrenzend an das Objektiv durchquert und dringt in die Netzhaut auf der Rückseite für das Auge, der subretinalen zu erreichen Platz14,15,16. Es erfordert jedoch stören die Netzhaut an zwei Standorten (Front- und Seitenzahnbereich), birgt das Risiko einer Beschädigung des Objektivs und Rückfluss von Zellen in den Glaskörper führen kann, wenn die Nadel zurückgezogen wird. Im Gegensatz dazu der Trans-Sklera Ansatz grundsätzlich vermeidet Beteiligung der Netzhaut und Glaskörper und Rückfluss beendet das Auge. Bei pigmentierten Nagetieren der Chirurg kann zunächst beobachten, Eindringen von der Sklera, aber nach dem Übergang in die pigmentierte Aderhaut, das Ende der Nadel ist nicht mehr sichtbar. Ohne direkte Beobachtung Verletzung der Netzhaut ist üblich und Netzhaut Dissektion und Lieferung von Zellen und/oder Blut in den Glaskörper führen kann. Darüber hinaus, da die Augenoberfläche gekrümmt ist, ist es sehr schwierig zu wissen, welche Nadel Winkel und Tiefe für Trans-skleralen Injektionen am effektivsten sind.
In diesem visualisierte Artikel stellen wir eine Trans-skleralen subretinalen Injektionsverfahren informiert durch den Einsatz von postoperativen Auswertungen mit optischen Kohärenztomografie (OCT), die eine detaillierte Untersuchung der Injektionsstelle ermöglichen. Unsere Trans-skleralen Injektionstechnik nutzt definierten Orten, Winkel und Tiefe für Injektionsnadeln, sehr niedrigen chirurgische Trauma und hohe Zuverlässigkeit zu produzieren. Hier zeigen wir speziell die Injektion von hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum der RCS Ratte, ein prä-klinischen Modell der menschlichen AMD. Mit dieser Methode Injektion lieferten wir erfolgreich und konsequent hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum des RCS Ratte Augen mit einer sehr hohen Erfolgsquote. Injektion von Zellen fand zuvor mindestens 2 Monate nach der Injektion13Erhaltung des RCS Photorezeptoren zur Folge. Dieses Verfahren wird unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt und ist leicht zu erlernen. Es erfordert zwei Personen (ein Chirurg und ein Assistent) die Injektion durchführen und die durchschnittliche Zeit der Injektion für jedes Tier ist weniger als 5 Minuten. Die definierten Winkeln und tiefen für Injektionsnadeln ermöglichen Labors, wo OAT nicht verfügbar sind, um erfolgreiche subretinale Injektion zu erreichen ist. Es ermöglicht hoch reproduzierbare subretinalen Zugriff und kann verwendet werden, nicht nur für Stammzelltransplantation, sondern auch für Medikamententherapien Lieferung und gen.
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Protocol
Alle Verfahren, bei denen Tiere wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der State University of New York at Albany genehmigt.
(1) Voreinspritzung Vorbereitung
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Vorbereitung einer hRPESC-RPE Zellsuspension
Hinweis: Die folgenden Schritte werden durchgeführt in sterilen Gewebekultur Haube und Vertrautheit mit sterilen Grundtechnik erforderlich ist.- Primäre hRPE Zellen zu isolieren von menschlichen Spender Augen im Alter von 50-90 Jahre und Zellkulturen in 24-Well Platten12. Tiefgefrieren der Zellen in der Passage 1, Tauwetter nach Bedarf und Kultur Durchlass 2 (P2) Zellen für 4-5 Wochen (Abbildung 1A) zur Injektion.
- Entfernen Sie das Kulturmedium12 und sanft spülen Brunnen zweimal mit 500 µL vorgewärmt 1 X Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium & Magnesium (1 x DPBS-CMF) durch Zugabe von 1 X DPBS-CMF in Brunnen mit einer 1.000 µL Pipette und entfernen sie mit einem Vakuum.
- Jedes gut 300 µL Trypsin/DNAse hinzufügen. Inkubieren Sie hRPESC-RPE-Zellen in Trypsin/DNAse (4 kU DNase pro 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA) für 4 min bei 37 ° C, die Zellen zu trennen.
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu sehen, ob sie aufgerundet haben. Weiterhin die Zellen in Trypsin/DNase für eine zusätzliche 2 min inkubieren, wenn sie noch nicht aufgerundet.
- Sobald die Zellen aufgerundet werden, verwenden Sie eine 1.000 µL Pipette genannte freistehenden Zellen aus dem Brunnen und übertragen die Trypsin/DNase mit freistehende Zellen in ein 15 mL konische Röhrchen in gleicher Lautstärke vorgewärmten Kulturmedium, Trypsin/DNase zu inaktivieren.
- Spülen Sie Brunnen mit vorgewärmten 1 X DPBS-CMF durch Pipettieren sanft auf und ab, besonders an den Rändern des Brunnens; Fügen Sie diese Zellen die vorherigen konischem Rohr.
- Zentrifugieren Sie das konische Rohr auf 286 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen Pellets.
- Den Überstand zu entfernen und die Zellen mit 1 mL Kulturmedium Aufschwemmen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
- Zentrifugieren Sie bei 286 X g für 5 min bei 4 ° C zu die Zellen zu Pellets.
- Entfernen des Überstands und Aufschwemmen Zellen in sterilen ausgewogen Salz Lösung (BSS) bei 50.000 Zellen/µL (, 50.000 Zellen in 1 µL Volumen während subretinale Injektion zu liefern).
- Übertragen Sie die endgültige Zellsuspension (CS) in eine 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch und halten in einem Eis-Wassergemisch bis zur Injektion Verwendung.
-
Vorbereitung der Zelle Injektor
- Legen Sie eine sterile abgeschrägte 33-Gauge-Nadel in die Injektionsspritze und Schrauben Sie fest an den Injektor zu montieren.
- Spülen Sie den Injektor mit 100 % igem Ethanol 5-6 Mal.
- Spülen Sie den Injektor mit 70 % Ethanol 5-6 Mal.
- Spülen Sie den Injektor mit BSS 5-6 Mal.
- Markieren Sie die Injektor Nadel mit einem sterilen schwarzen Filzstift an einer Position von 600 µm weg von der Spitze der Nadel unter dem sezierenden Mikroskop (Abbildung 1 b).
- Legen Sie den Injektor auf einem Mikromanipulator Injektionslösung.
(2) subretinale Injektion
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OP-Bereich und tierische Vorbereitung
- Eine 4-5 Wochen alten RCS Ratte (60-100 g) wiegen und betäuben mit Isofluran-Dampf-Delivery-System.
Hinweis: Induzieren Anästhesie halten die Isofluran Durchflussgeschwindigkeit bei 5 %. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose mit den Pfoten, und reduzieren Sie die Durchflussmenge auf 2-3 % für Anästhesie Wartung während der Operation. - Legen Sie eine sterile OP drapieren, mit einem Heizkissen unter, auf der Bühne des sezierenden Mikroskops eine sterile OP-Bereich einrichten.
- Übertragen Sie die Ratte auf den OP-Bereich und die Ratte in einem Prüfkopf angeschlossenen Isoflurane Narkose halten.
- Die Ratte Körper mit Gaze abdecken. Kneifen Sie die Ratte Zehe, um Vollnarkose zu bestätigen.
- Eine 4-5 Wochen alten RCS Ratte (60-100 g) wiegen und betäuben mit Isofluran-Dampf-Delivery-System.
-
Trans-skleralen subretinale Injektion unter die Lupe genommen
- Geben Sie einen Tropfen des Auges Schmiermittel auf die Ratte unbetätigter Auge.
- Positionieren Sie die Ratte auf der rechten Seite mit dem linken Auge mit Blick auf die Decke für Injektion, seinen Kopf in Richtung der rechten Hand des Operateurs und den Rücken in Richtung der Chirurg.
- Schneiden Sie Schnurrhaare, die das Auge mit einer kleinen Schere abdecken.
- Tropfen Sie eine kleine Menge der Augendusche von der zeitlichen Seite des linken Auges und sammeln Sie die Selbstbeteiligung an der nasalen Seite mit einem Baumwoll-Applikator, das Auge zu spülen.
- Erweitern Sie die Pupille mit 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin (frisch hergestellt aus 10 % Phenylephrin durch verdünnen es am Tag der Operation in steriler 0,9 % Kochsalzlösung) nach der Injektion OCT-Prüfung durch die Anwendung ein Tropfen von jedem.
- Ziehen Sie vorsichtig die Haut rund um das Auge 4-6 Mal, das Augenlid zu öffnen, so dass das Auge leicht Proptosed für einen leichteren Zugang zu Regionen nach der Limbus ist.
- Geben Sie einen Tropfen der Augendusche und halten Sie das Auge feucht zu.
- Sanft die CS (vorbereitet in Schritt 1.1.12) genannte und laden Sie den Injektor mit 1,2 µL CS. Die extra 0,2 µL dient zur Injektion Rückfluss zu kompensieren.
Hinweis: Basierend auf unseren Messungen über 5.000-8.000 Zellen sind in den Rückfluss mit einer Injektion von 50.000 Zellen/µL, das entspricht etwa 10-16 % des Zellverlustes verloren und ein Aufpreis von 0,2 µL CS injiziert wurde, um diese Zelle Verlust zu kompensieren. - Legen Sie den Injektor mit CS auf einem Mikromanipulator gefüllt (oder haben einen Assistenten, die es zu halten) vertikal als RPE Zellen neigen dazu, leicht in der Schwebe zu versenken.
- Tragen Sie einen Rückgang von 0,5 % Proparacaine (lokale Lokalanästhetikum auf) auf das Auge und entfernen Sie das überschüssige mit einem Baumwoll-Applikator.
Hinweis: Dieser Schritt sollte die Hornhaut Reflex zu unterdrücken und verhindern, dass das Auge blinkt während der nachfolgenden Schritte. - Verwenden Sie Zange zu greifen die Bindehaut posterior, den Limbus, drehen das Auge nasal und heben die Bindehaut um ein "Zelt" zu machen.
- Mit einer Schere oben auf das "Zelt" abgeschnitten, machen eine kleine Öffnung in der Bindehaut und der zugrunde liegenden Sklera setzen.
- Verwenden Sie Zange zu greifen den Rand von den restlichen Bindehaut Rand neben dem Limbus und das Auge nasal zu drehen, so dass die Pupillen Achse in einem Winkel von etwa 30 Grad bezogen auf die Tischplatte (Abbildung 1). Weiterhin greifen der Bindehaut Marge braucht man um eine Gegenkraft während Nadel Einschübe zur Verfügung und das Auge in einem optimalen Winkel zu erhalten.
- Um ein Kernloch für Zelle Injektion zu machen, legen Sie das Ende einer sterilen abgeschrägte 31-Gauge-Insulin-Nadel bei 1.200-1.500 µm nach dem Limbus mit der Eröffnung der Spitze nach oben zeigt.
- Stellen Sie den Winkel der Insulin-Nadel, so dass es 10-15 Grad über der Sklera (tangential zu einer imaginären Ebene an der geplanten Einstichstelle). Dringen Sie langsam die Lederhaut-Aderhaut-Komplex mit einer Nadel Tiefe von etwa 500 µm. Bei pigmentierten Ratten wird am Ende der Nadel unter die pigmentierte Aderhaut "verschwinden". Für die Marke des hier verwendeten Insulin-Nadel ist der Abstand zwischen der Spitze der Nadel die Abschrägung 500 µm.
- Zurückziehen Sie vorsichtig, die Insulin-Nadel (eine sehr kleine Erguss des Blutes kann gesehen werden).
- Wenn starke Blutungen vermerkt ist, kann ein Auge Speer angewendet werden um das Loch zu löschen falls erforderlich. Anhaltende Blutungen nach die Speer-Anwendung ein Schiff zeigt kann beschädigt worden sein.
- Führen Sie die RPE Zellen geladen Injektor Nadel in die Pilotbohrung mit der Öffnung nach unten, und in einem Winkel von etwa 10-15 Grad relativ zur lokalen Oberfläche der Sklera.
- Sanft den Injektor Nadel in die Pilotbohrung bis zu einer Tiefe von etwa 500 µm auf den subretinalen Raum zugreifen. Es sollte über einen 100 µm Spielraum zwischen dem Rand der schwarzen Stift Marke und dem Punkt, wo die Nadel durch die pigmentierte Aderhaut (Abbildung 1 und 1 D) abgedeckt ist.
- Fragen Sie den Assistenten, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze Injektor das entsprechende Volumen der Zellen (ca. 1,2 µL) zu injizieren. Bereit sein, einige Gegenkraft als Assistentin auf den Kolben drückt.
Hinweis: Vorherige mock Praxis mit dem Assistenten kann die Chirurgen und Mitarbeiter mit der notwendigen Erfahrung mit diesem Schritt bereitstellen. - Visuell mit Schwerpunkt auf den Stift markieren Sie Rand zu, halten Sie den Injektor für 25-30 s und dann zurücknehmen Sie langsam des Injektors. Eine kleine Menge der Rückfluss wird allgemein beobachtet.
Hinweis: Wenn kein Rückfluss zu beobachten ist, möglicherweise gab es eine intravitreale Injektion. Siehst du Rückfluss durch die Dichtung oder Zellen füllen unterhalb der Sklera, war die Injektion zu flach. - Spülen Sie die Zelle Ausfluss aus der Injektionsstelle mit sterilem Augendusche 3 Mal und sammeln Sie den Überschuss mit einem Baumwoll-Applikator.
- Geben Sie einen Tropfen des Auges Schmiermittel auf dem operierten Auge und transfer die Ratte zum OCT, den Speicherort der transplantierten Zellen und die Größe der subretinalen Lungenblase zu untersuchen.
(3) nach der Injektion Behandlung
-
Entzündungshemmende und Schmerz Reliever-Behandlung
- Injizieren Sie Buprenorphin bei 0,1 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung subkutan, um Schmerzen zu verringern.
- Dexamethason bei 1,6 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung durch intraperitoneale Injektion (i.p.) für die Entzündung Kontrolle zu injizieren.
-
Tierische Erholung
- Zurück die Ratte in den Recovery-Käfig unter einer Wärmelampe auf Körpertemperatur zu halten.
- Beobachten des operierten Auges auf Anzeichen einer Blutung.
- Beobachten Sie die Ratte um sicherzustellen, dass sie aus der Narkose kommt.
- Zurückkehren Sie das wiederhergestellte Tier zu einem frischen Käfig und kennzeichnen Sie den Käfig mit einer Operation Karte und überwachen Sie täglich auf Anzeichen von Not, okuläre Blutung oder Hornhauttrübungen. Benachrichtigen Sie den Tierarzt sofort, wenn Bedenken bestehen.
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Representative Results
Wenden Sie die in diesem Artikel beschriebenen Technik lieferten wir konsequent hRPESC-RPE-Zellen in den subretinalen Raum des RCS Ratten durch die präzise Steuerung der Position, Winkel und Tiefe der Injektor Nadel einfügen in das Gewebe (Abbildung 1 b-D ). Sofort war folgende Transplantation, eine OCT-Untersuchung durchgeführt, um die Injektionsstelle und der subretinalen Lungenblase erstellt durch die transplantierten Zellen zu beobachten. Postoperative OCT Evaluierung dient als Screening-Instrument zur Beurteilung der Qualität von Injektionen und Überwachung von retinalen Blutungen und Beschädigungen. Sowohl der subretinalen Lungenblase (Abb. 2A, C und D) und die Injektionsstelle (Abb. 2A und B) konnte unter Office-Anpassungstool Scannen deutlich gesehen werden. Die subretinale Lungenblase löst in der Regel innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion. Messung der Größe von Blebs ist, zwar schwierig mit OCT können wir abschätzen, vorausgesetzt, es entspricht der Photorezeptor-Schutzgebiet durch Zelltransplantation Lungenblase Bereich. Wir zuvor gezeigt, dass eine 1 µL Injektion von 50.000 Zellen führen könnte, etwa 6-7 % sparen Bereich der RCS Netzhaut um die Injektion Seite13. Wie in Abb. 2A, C und D, die Netzhaut gezeigt, dass Schichten an der Injektionsstelle intakt waren, wurde kein Blut in der Blase festgestellt und keine Zellen im Glaskörper, zeigt minimales Trauma verursacht durch die Injektion beobachtet wurden. Darüber hinaus wurden repräsentative OCT-Bilder von ausgefallenen Injektionen auch als Referenz (Abb. 2E und F).
Mit dem Einsatz von OCT als ein Feedback-Tool optimiert den Winkel und die Tiefe der Injektor Nadel Einfügung in das Gewebe. Sobald optimiert, scheitert diese Methode erlaubt eine Erfolgsquote von 90,8 % subretinalen Zugang mit nur 5,7 % chirurgische erreichen wir, basierend auf den Ergebnissen von mehr als 300 bisherigen subretinalen Injektionen durchgeführt in unseren anderen Studien13 (Tabelle 1). In den verbleibenden 3,5 % wurden den ÜLG nicht aus mehreren Gründen, einschließlich der Augen nicht in eine adäquate Position aufgrund Isoflurane Narkose verbundenen Augenrollen17durchgeführt.
7 Tage nach der Transplantation waren die betriebenen Ratte Augen fest- und geschnittenen Immunohistologische Analyse enukleiert. Eine menschliche Zelle nuklearen Marker (Hunu)18 und eine RPE Zelle Marker (OTX2)19 wurden verwendet, um die transplantierten Zellen zu erkennen. Abbildung 3 zeigte eine dicke Schicht von transplantierten RPE-Zellen in den subretinalen Raum, der eine Woche nach der Injektion, positiv mit beiden Markern gefärbt wurde bestätigt die Identität und die erfolgreiche Durchführung der Transplantation. Eine Woche nach der Injektion kann die große Anzahl von Zellen, wie in Abbildung 3dargestellt, eine kleine Anzahl später wegen Host Immunantwort auch bei immunsupprimierten RCS Ratten20rapide. Trotzdem, wie oben erwähnt, die degenerierten Photorezeptor-Schicht des RCS Ratte Augen finden Sie für mindestens 2 Monate nach der Transplantation mit hRPESC-RPE13gerettet werden.
Abbildung 1 : Bild 4 - Wochen alten P2-hRPESC-RPE-Zellen und eine Demonstration der Winkel und Tiefe, die die Injektor Nadel während der Injektion verwendet. (A) ein Bild mit Phasenkontrast-der 4 - Wochen alten P2-hRPESC-RPE-Zellen verwendet für die Injektion. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) eine schematische Darstellung zeigt den 600 µm-Abstand zwischen dem Rand der Markierung und der Spitze der Injektor Nadel durch eine Microscale gemessen. Die minimale Graduierung der Microscale ist 100 µm. (C) eine Karikatur zeigt den Querschnitt der anatomischen Struktur des Auges eine Ratte und seitlichem Blick auf die Winkel und Tiefe, die die Injektor Nadel in die Augenwand einfügt. Die Pupillen Achse des Auges Ratte ist 30 Grad bezogen auf die Tischplatte und die Injektor Nadel ist 15 Grad relativ zur lokalen Oberfläche des Augapfels. (D) eine Karikatur zeigt den Ausgangspunkt des Markers auf den Injektor Nadel und die Draufsicht auf die Injektionsstelle 500 µm der Injektor Nadel in das Gewebe und eine 100 µm-Bereich eingefügt bleibt zwischen der Eröffnung des Lochs Injektion und dem Rand der marke r. die Lage der Bohrung ist 1.200-1.500 µm nach dem Limbus. Die Nadelspitze ist auf seiner Seite gezeigt, aber sollte verdeckt während der Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : OCT Bilder des Auges sofort nach der Injektion betriebenen Ratte. (A) ein OCT B-Bild von einer operierten Auge zeigt eine subretinale Lungenblase und Injektion Website ohne intravitreale Blutung. (B) ein OCT Volumen Intensität Projektion (VIP) Bild einer B-Scan-Serie repräsentieren das Enface Fundus Bild der Injektionsbereich. Die kleine Einstichstelle ist sichtbar in der VIP-Bild zeigt die minimale Trauma. (C) ein vergrößertes OCT-Bild (A) zeigt die transplantierten Zellen in den subretinalen Raum mit allen Schichten der Netzhaut gekennzeichnet. Dieses Bild gezeigt, dass die transplantierten Zellen in den subretinalen Raum befanden. (D) ein OCT B-Scan-Bild zeigt eine Durchschnittsgröße subretinalen Lungenblase. (E) ein OCT B-Scan-Bild zeigt eine fehlgeschlagene subretinale Injektion mit CS befindet sich im Bereich intravitreale. (F) ein OCT B-Scan-Bild zeigt eine fehlgeschlagene subretinale Injektion mit der gesamten Netzhaut stossen durch an der Injektionsstelle. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Immunohistologische Anfärbung der gefrorenen Abschnitte nach der Transplantation der hRPESC-RPE-Zellen der Netzhaut. (A) menschliche Zelle nuklearen Marker (Hunu) Färbung zeigt die Erkennung von transplantierten menschlichen RPE-Zellen. (B, E) Zelle nuklearen Zähler Färbung (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole; DAPI) zeigt die Netzhaut Schichten, die Transplantation und RPE Schicht. (C) eine zusammengefügte Bild Hunu und DAPI darauf hinweist, dass die transplantierten hRPE Zellen in den subretinalen Raum befinden. Die Trennung zwischen der Transplantation und RPE-Schicht ist eine Verarbeitung Artefakt Cryo-Schutz RCS Augen für Gefrierschnitte zugeordnet. (D) RPE Zelle Marker (OTX2) Färbung des transplantierten menschlichen RPE-Zellen. (F) eine zusammengeführte Bild des OTX2 und DAPI. Maßstabsleiste = 20µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Insgesamt injizierten RCS Ratte Augen | Gute subretinalen Blebs unter OCT | Kleinen subretinalen Blebs unter OCT | Insgesamt unkomplizierten subretinalen Blebs unter OCT | Komplizierter subretinalen Blebs unter OCT (d.h. Luftblase oder Netzhautblutungen) | Keine OCT durchgeführt | Chirurgische fehlschlägt (keine subretinalen Lungenblase unter OCT) | |
| Graf | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % der gesamten injizierte Augen | ------ | 82.80 % | 7,96 % | 90.76 % | 1,59 % | 1,91 % | 5,73 % |
| (Diese Daten werden von zehn Kohorten von subretinalen Injektionen bei RCS Ratten zusammengefasst) | |||||||
Tabelle 1: Zusammenfassung der subretinalen Injektionen von zehn experimentelle Kohorten im RCS Ratten.
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Discussion
Die subretinale Injektionstechnik dargestellt in diesem Artikel wird über den Trans-skleralen Weg, wo die Injektor Nadel die Randschichten (Lederhaut-Aderhaut-RPE Komplex) die Augenwand dringt, ohne die neuronale Netzhaut schädigen oder stören den Glaskörper Hohlraum. Ein alternative Trans-Glaskörperblutung Ansatz hat ein potenzielles Risiko Objektiv Schaden führt zu Katarakt, da Nagetiere Objektiv befindet sich den Großteil der Glaskörper Hohlraum. Im Vergleich zu dieser Methode, unsere Technik ist weniger riskant und minimales Trauma verursacht, da die Injektor Nadel nicht braucht, über die gesamte Glaskörper Hohlraum um den subretinalen Raum zu erreichen. In der Tat, OCT-Untersuchungen in unseren Studien zeigten sehr seltene Netzhaut eindringen Ereignisse und im Follow-up-Prüfungen bei Tieren, gibt es keine anhaltende Netzhautablösungen. Darüber hinaus die Injektionsstelle ist sehr klein (< 200 µm im Durchmesser) als mit einem 33-Gauge Injektor Nadel, damit die strukturellen Störung der Lederhaut-Aderhaut-RPE Anlage sehr begrenzt ist. Nach zurückziehen der Nadel die Injektion Loch selbst verschließt automatisch also kein Stich oder Gewebekleber benötigt wird.
Komplikationen bei der Operation gehören übermäßige Blutungen rund um den Bereich der Injektion oder von innen die Pilotbohrung. Wenn Zange verwenden, um die Bindehaut Marge mit dem Limbus zu greifen, ist nur sanfter Gewalt erforderlich, Blutgefäße einklemmen vermeiden und mögliche Blutungen zu verringern. Vor dem Erstellen der Pilotbohrung, prüfen der vorgesehenen Einstichstelle um Eindringen von oberflächlichen Blutgefäße zu vermeiden. Mit einem Speer, kann die Pilotbohrung Blut vor dem Einsetzen der Injektionsnadel Zelle gelöscht werden. Wenn Blutungen aus der Pilotbohrung nach wenigen Anwendungen des Speeres auftritt, kann ein Schiff gebrochen wurden. Eine weitere Komplikation, die wir beobachtet wird ein geringer Prozentsatz der RCS Ratten Hornhauttrübungen postoperativ zu entwickeln. In einigen Fällen die Trübungen waren chronische und andere waren vorübergehend. Tiere mit persistenten Linsentrübungen wurden aus der Studiengruppe entfernt. Hornhauttrübungen können wegen Augentrockenheit, körperliche Schäden, Entzündungen, Medikamente oder chemische Reizung21entwickeln. Um ihre Bildung zu reduzieren, das Auge sollte feucht gehalten werden, durch die Aufrechterhaltung ausreichend Auge Schmierung, und vermeiden Sie jede Berührung der Hornhaut mit einem Baumwoll-Applikator oder andere Tools während des Betriebs.
Die Injektion Protokoll beschriebenen hier Verwendungen definierte Vorgehensweise Winkel und Nadel tiefen relativ okuläre Wahrzeichen und Auge Winkel im Verhältnis zu den OP-Tisch in unserer Einrichtung. Die Verwendung von nach der Injektion OCT Scans war wichtig diese Einspritzparameter um reproduzierbare Kontrolle der RPE Zelltransplantation in die Ratten subretinalen Raum mit hoher Genauigkeit zu verfeinern. Sobald Sie durch wiederholte Praxis beherrscht, ist die Methode einfach durchzuführen. Es wird empfohlen, vor allem in der Ausbildung, dass postoperative okuläre Prüfungen durchgeführt werden, um Ergebnisse zu bestimmen. Den Winkel und die Tiefe der Injektion Nadel wird wahrscheinlich benötigen Anpassung entsprechend auf dieses Feedback je nach chirurgischen, Alter des Tieres, und/oder wenn andere Tierarten verwendet werden (z.B. Maus).
Um die Injektion Qualität bewerten und Einbeziehung oder den Ausschluss aus einer Studie zu bestimmen, ist das Vorhandensein von subretinalen blutete aus OCT Beobachtung entscheidend. Im Labor, wo OCT nicht verfügbar ist, die unten beschriebenen Kriterien eignet sich für ein schnelles Screening von Chirurgen auszuschließende vermuteten Injektion schlägt fehl: (1) vor der Injektion: (a) Pilot Loch ist zu tief gemacht (d.h., bedeutende Tiefe > 500 µm; für die Marke der Insulin-Nadel verwendet hier, die Entfernung von der Spitze der Nadel in die Mitte der Abschrägung ist 500 µm). (b) Pilotbohrung blutet übermäßig (d.h.Blutungen kann nicht gestoppt werden durch Krafteinwirkung auf das Loch mit Auge Speere). (c) die Injektionsnadel geht zu tief (d.h., bedeutende Tiefe > 500 µm oder der Marker auf Injektionsnadel geht in das komplexe Gewebe der Sklera, Aderhaut/RPE). (2) während der Injektion: (a) kann nicht weiterhin die Injektionsnadel in die Pilotbohrung beim Einspritzen. (b) Leckage sofort um die Injektionsnadel beim Einspritzen. (c) die Injektionsnadel zu tief gedrückt wird (d. h., der Marker auf der Injektionsnadel geht in das komplexe Gewebe der Sklera, Aderhaut/RPE) wie durch den Chirurgen während der Injektion bemerkt. (d) kann nicht für länger als 5 Sekunden nach der Injektion die Injektionsnadel in Position aufrecht zu erhalten. (e) übermäßige Blut, wenn die Injektionsnadel zurückziehen. (f) kein Rückfluss/Ausfluss nach Widerruf der Injektionsnadel in Kombination mit Schritt 2 gesehen.
Zusammengenommen mit sorgsamen Umgang mit der Nadelposition, Winkel und Tiefe, die Trans-skleralen subretinalen Injektionstechnik ist sehr zuverlässig, präzise und minimale chirurgische Trauma führen kann. Mit all diesen Vorteilen kann diese Technik nicht nur für die Lieferung von RPE-Zellen, sondern auch für andere Zelltypen, Verbindungen oder Gentherapien verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir wünschen Patty Lederman Danke für ihre Hilfe auf der Chirurgie und Susan Borden für RPE Zellen Vorbereitung. Wir anerkennen auch NYSTEM C028504 für die Finanzierung für dieses Projekt. Justine, die D. Miller von NIH unterstützt wird gewähren F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
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- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
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