Summary
פרוטוקול עבור סינתזה, טיהור, אפיון מעכב מבוססי רותניום של ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי מוצג. הליך כדי להעריך את יעילותה בתאים בתרבית של permeabilized הוא הפגין.
Abstract
אנו מפרטים את סינתזה ולטיהור סידן מיטוכונדריאלי מעכב ספיגת, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 +. הסינתזה אופטימיזציה של מתחם זה מתחילה [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 ב 1 מ' NH4או במיכל סגור, מניב פתרון ירוק. טיהור מתבצע עם כרומטוגרפיה קטיונים. מתחם זה מאופיין, אומתו ספקטרוסקופיה מול UV ו- IR כדי להיות טהורים. המאפיינים המעכבת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי הם העריכו בתאים הלה permeabilized על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה.
Introduction
סידן מיטוכונדריאלי הוא מווסת מפתח עבור מספר תהליכים חיוניים לתפקוד תאים נורמליים, כולל הפקת אנרגיה אפופטוזיס. 1 , 2 , 3 uniporter סידן מיטוכונדריאלי (MCU), חלבון טרנספורטר יון ונותק מיטוכונדריאלי ממברנה פנימית, מווסת זרם של יונים של סידן לתוך המיטוכונדריה. 4 , 5 , 6 מעכבי כימי של לפשעים חמורים הם כלי רב ערך עבור המשך המאמצים לחקור את תפקוד ואת תפקידי הסלולר לשנע חלבון וסידן מיטוכונדריאלי הזה. מתחם [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, הוא אחד מעכבי סלקטיבי ידוע רק עבור לפשעים חמורים עם ערךד K המדווחת של 24 מיקרומטר.7 ,8,9,10 מתחם זה ממוקם הטומאה נפוצה מצאו ניסוחים מסחרי של רותניום אדום (RuRed), di triruthenium-ממוצע-אוקסו לגשר hexacation של הנוסחה [(NH3) 5 (ממוצע-O) Ru Ru (NH3)4(ממוצע-O) Ru (NH3)5)]6 +, אשר שימש גם בתור מעכב ספיגת סידן. למרות Ru360 זמין מסחרית, זה מאוד יקר. יתר על כן, סינתזה של בידוד של Ru360 קוראים תיגר על ידי טיהור קשה נהלים ושיטות אפיון דו-משמעי
לאחרונה דיווחנו הליכים חלופיים כדי לגשת Ru360 אנלוגי, [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5. 11 מתחם זה מעכב לפשעים חמורים עם זיקה גבוהה, הדומה Ru360. ב פרוטוקול זה, נתאר שלנו סינתזה היעיל ביותר של מתחם זה, המתחיל [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2. טיהור של המוצר באמצעות שרף קטיונים חומציים מאוד מפורט, יחד עם מלכודות נפוצות עבור הליך זה. אנחנו גם להציג שיטות אפיון והערכת טוהר מורכבים, ניסחו בגישה פשוטה לבדיקת יעילותה על חסימת ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
: מרוכז חומצות ובסיסים המשמשים סינתזה זו. השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע התגובה כולל השימוש של פקדים הנדסה (fume הוד), ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כולל בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, באורך מלא מכנסיים ונעליים סגורות.
1-הכנת [(או 2) (NH 3) 4 Ru (ממוצע-O) Ru (NH 3) 4 (או 2)] Cl 5
- סינתזה של Cl [Ru (NH 3) 5 קלרנית] 2 12
- g 1.00 התמוססות של RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru לפי משקל, 4.1 mmol) ב 5 מ של H 2 O. מגניב הפתרון חום כהה 0 ° C באמבט קרח. להוסיף 11 מ ל (0.23 mol) של 80% הידרזין מימה פתרון באופן dropwise. התגובה הראשונית תהיה נמרצת עם הגז האבולוציה, וכתוצאה מכך פתרון חום. תן הפתרון שיתקבל מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 16 שעות; הפתרון הסופי יהיה כהה חא
זהירות: הידרזין היא בחריפות רעילים ומסרטנים. בנוסף, נטול מים צורות של ריאגנט הזה הם חומר נפץ. כמו תמיד, השתמש וקולטי עיקרון השוויון הפוליטי, fume המתאימה בעת הטיפול. לא להתרכז אלה פתרונות ליובש. - כדי פתרון זה, להוסיף כ 5-10 מ של HCl מרוכזת כדי להתאים את ה-pH ל- 2. בשלב זה, הפתרון יהיה צהוב-חום בצבע.
- חום פתרון זה ב 105 ° C תוך ערבוב במשך 1-2 h. מוצק צהוב לזרז מתוך פתרון. כאשר אין יותר לזרז בעליל טפסים, מסירים מהאש.
- לאפשר תערובת התגובה כדי להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מקם באמבט קרח 0 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לאסוף את המוצק צהוב על-ידי סינון ואקום לשטוף עם 5 מ ל כל אחד אתנול וביו -דיאתיל אתר.
- נמסים לחלוטין את המוצר הגולמי ב- 15-25 מ של מים חמים. מקררים 10 מ"ל של פתרון HCl מרוכזת בבקבוקון מסנן על-ידי הצבתו באמבט קרח. לסנן את הפתרון צהוב בתוך תמיסת HCl צוננת לזירוז משקעים של מוצק טהור צהוב חיוור. לסנן את התמיסה ולשטוף עם 5 מ ל כל אחד של 0.5 M HCl, אתנול ואתר.
- Characterize מתחם באמצעות IR ספקטרוסקופיה. לאמת טוהר על ידי זיהוי תדרי מתיחה-3226 ס מ -1 ס מ 1604 -1, 1297 ס מ -1, 801 ס מ -1. הטומאה קטין נפוצים ב 2069 ס מ -1 מוקצה [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- g 1.00 התמוססות של RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru לפי משקל, 4.1 mmol) ב 5 מ של H 2 O. מגניב הפתרון חום כהה 0 ° C באמבט קרח. להוסיף 11 מ ל (0.23 mol) של 80% הידרזין מימה פתרון באופן dropwise. התגובה הראשונית תהיה נמרצת עם הגז האבולוציה, וכתוצאה מכך פתרון חום. תן הפתרון שיתקבל מערבבים בטמפרטורת החדר במשך 16 שעות; הפתרון הסופי יהיה כהה חא
- סינתזה של Cl [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2)] 5
- להמיס 100 מ ג (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 קלרנית] Cl 2 ב- 50 מ של 1 מ' NH 4 או מגרגרי לחץ עגול עם תחתית הקיר כבד 200 מ. ברפיון שווי הבקבוק עם פקק, לחמם את תערובת התגובה ב 75 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ להסיר מהאש ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 4 ימים להניב פתרון ירוק כהה-
זהירות! חימום של תוצאות כלי אטום שיצטברו לחץ. הקפד להשתמש כלי זכוכית לחץ-בטוח המתאים. התגובה הזו, המטרה של איטום הספינה היא למזער אובדן של NH גז 3. לכן, למקם את פקק באופן רופף כדי לאפשר את שחרורו של לחץ עודף.
- להמיס 100 מ ג (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 קלרנית] Cl 2 ב- 50 מ של 1 מ' NH 4 או מגרגרי לחץ עגול עם תחתית הקיר כבד 200 מ. ברפיון שווי הבקבוק עם פקק, לחמם את תערובת התגובה ב 75 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ להסיר מהאש ומערבבים בטמפרטורת החדר במשך 4 ימים להניב פתרון ירוק כהה-
- טיהור באמצעות כרומטוגרפיה קטיונים
- בגביע, 25 מ ל להשעות 5 g-קטיון שרף (למשל, Dowex 50WX2 200-400 מחוט (טופס H +) 10 מ ל 0.1 M HCl.
- טען הזה slurry לתוך עמודה 10 מ"ל (בקוטר 10 מ מ, גובה 15 ס מ) מודבקת עם מאגר הממס 50 מ. לשטוף את השרף כ 20-30 מ של 0.1 M HCl, עד eluate חסר צבע.
- להחזיר הפתרון הירוק התגובה מבודד בשלב 1.2.1. כדי פתרון זה, להוסיף HCl מרוכזת כדי להתאים את ה-pH ל- 2, ובשלב צבע פתרון משתנה לחום.
- טען הפתרון acidified אל העמודה שרף-קטיון שהכין בשלב 1.3.2 בעדינות pipetting זה על גבי השרף. תן את eluate לחלוטין לנקז, להמשיך לטעון את הפתרון. חזור על תהליך זה עד הפתרון כולו נוספה. החלק העליון של השרף יהיה חום כהה/שחור. השרף תגרום להקטנת נפח מעט.
- שימוש חרוזי זכוכית כדי לכסות את החלק העליון של השרף. אלה ימנע השרף שמפריעים כאשר פתרונות חדשים מתווספים.
- Elute את העמודה עם 20 מ של 1 M HCl.
- Elute את העמודה עם ריכוז HCl מוגברת 1.5 M (≈ 50 מ ל). פתרון צהוב יתחיל להוריד את העמודה. להעלות את ריכוז HCl עד 2 מ' ולהמשיך eluting עד eluate חסר צבע או ירוק-צהוב חיוור מאוד. הנפח הכולל של 150-200 מ ל יידרש לתהליך זה.
- להגדיל את ריכוז HCl עד 2.5 מ' (20-50 מ"ל). לאסוף את eluate כשברים במבחנות. להגדיל את 3 M HCl. המוצר elute עמודה כמו פתרון ירוק-חום. שבר אדום-חום יכול גם להתחיל תיפרדי העמודה. כמו שברים אלה הם זיהומים האדומים מחומצן רותניום, לא בריכה עם שברים ירוק-חום.
- איפיון ואימות של טוהר [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2) Cl 5
- מבחן כל השברים מן שלב 1.3.8. על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה. כדי לבצע משימה זו, להוסיף 100 µL של השבר נתון לתוך 2 מ"ל של 3 מ' NH3, לנתח ידי UV-vis ספקטרוסקופיה. שברים המכיל מוצר טהור תהיה להקה גדולה ספיגת ב 360 nm ו של ספיגת פחות אינטנסיבי על 600 ננומטר. ספיגת-480 או 533 ננומטר הוא מרמז על האדומים מחומצן רותניום וזוהמה רותניום אדום, בהתאמה.
- מאגר שברים המכיל מוצר טהור, מתאדים הפתרון ליובש אידוי רוטרי. המוצר יהיה מבודד כמו מוצק ירוק-חום. התשואות הם בדרך כלל גודל 5-15 מ ג (10-20% תשואה). יחיד-גבישים, מתאים עקיפה של קרני רנטגן, יכולה להיות מושגת על ידי פעפוע אדי אתנול לתוך פתרונות מימית של המתחם-
- כדי לוודא טוהר, לנתח את המתחם על ידי UV-vis ספקטרוסקופיה בפתרון של תמיסת באגירה פוספט pH 7.4 (PBS). טוהר עשויים להידרש, על ידי לקיחת היחס בעוצמה של 360 nm ו 600 nm פסגות. יחס זה הוא 31 עבור תרכובת טהורה. עבור תרכובות טמא, היחס יהיה קטן יותר.
- לנתח את הדגימה בתוך המדינה מוצק ידי ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום. להקות האבחון הינם 3234 ס מ -1 ס מ 3151 -1, 1618 ס מ -1, 1313 ס מ -1, 815 ס מ -1. להקות הטומאה נפוצים הם ראו ב 1762 ס מ -1 ו- 1400 ס מ -1, האופייניים NH 4 Cl. רותניום אדום ניתן לזהות על ידי להקות 1404 ס מ -1, 1300 ס מ -1, 1037 ס מ -1 ו ס מ 800 -1.
- הערכה של עיכוב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי על-ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה
זהירות! ההליכים הבאים שימוש בתרבית של תאים. העבודה צריכה להתבצע בברדסים זרימה שכבתית המתאימה שאושרו עבור בטיחות ביולוגית ברמה 2 מחקר (BSL2).
הערה: [(או 2) (NH 3) 4 Ru Ru (ממוצע-O) (NH 3) 4 (או 2) Cl 5 להתייחס כמו [Ru] בסעיף זה- להפוך buffered גלוקוז המכיל תמיסת מלח (BGSS) התקשורת וזמינותו. BGSS הוא פתרון הכוללת 110 מ מ אשלגן כלורי, 2 PO 1 מ מ ח' 4, 1 מ MgCl 2, 20 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), succinate נתרן 5 מ מ, 30 מיקרומטר אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-חומצה tetraacetic (EGTA). לשלב את הכל חוץ EGTA, להתאים את ה-pH ל 7.4. להוסיף EGTA והתאם pH ל 7.4. עבור 50 מ של מדיה assay להוסיף 0.5 מ"ל של גלוקוז 1 מ"ג/מ"ל.
- הלה התרבות התאים ב- 500 ס מ 2 צלחות פטרי ב- Dulbecco ' s בינוני נשר שונה (DMEM) עם 10% עוברית שור סרום (FBS) ב חממה humidified עם 5% CO 2-37 ° C. להגביר את הלה גדל התאים ב- 100 מ מ פטרי על ידי זריעה אותם בצלחת פטרי 2 ס מ 500. 115 מ ל שאמצעי האחסון מדיה סה כ צלחת גדולה. כל מנה גדולה תניב כ-18 מיליון תאים, מספיק בשביל שני ניסויים ספקטרוסקופיה של זריחה.
- לגדל את התאים עד שיגיעו 90-95% confluency. להסיר מדיה, ולשטוף את התאים עם 15 מ"ל pH 7.4 PBS. להוסיף 15 מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) של 1 מ מ ב- PBS, תקופת דגירה של 10 דקות לנתק את התאים. להעביר את התאים 14 מ"ל סביב צינורות בז התחתון
- לספור תאים באמצעות trypan blue ו- hemocytometer עם מיקרוסקופ הפוכה, ולחשב את המספר הכולל של תאים ונפח של התקשורת צריכה להגיע 7.5 מיליון תאים לכל אמצעי אחסון 1.8 mL בינוני. Centrifuge התאים 10 דקות ב × 5310 ג'י Decant תגובת שיקוע והוסף את הנפח מחושב של BGSS. Resuspend תאים בעדינות.
- בשביל זה assay, הכנת מלאי פתרונות של 40 מ מ digitonin ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 1 מ מ סידן ירוק-5N H 2 O, ו- 10 מ"מ CaCl 2 H 2 O. [Ru] מניות פתרונות, מוכן במים טהורים, נע בין 1-3 מ מ.
הערה: סידן ירוק-5N הוא רגישים לאור. לאחסן בחושך, למזער חשיפה קלה.
- בשביל זה assay, הכנת מלאי פתרונות של 40 מ מ digitonin ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 1 מ מ סידן ירוק-5N H 2 O, ו- 10 מ"מ CaCl 2 H 2 O. [Ru] מניות פתרונות, מוכן במים טהורים, נע בין 1-3 מ מ.
- התקנה של fluorimeter כדי לרגש-506 nm וקריאה הפליטה-532 ננומטר עם cuvette-מחזיק נשלטת על 37 ° C. הכן cuvette אקריליק עם בר מערבבים או גלגל, ההשעיה תא 1.8 mL מ 1.5.2 לעיל, 1.8 µL digitonin פתרון, 3.6 & #181; L סידן ירוק-5N (פתרון), µL 9 [Ru] (עבור פתרון מניות 1 מ"מ, 5 מיקרומטר הריכוז הסופי). דגירה תאים למשך 15 דקות fluorimeter.
- לקרוא את הנתונים כיחס עירור/פליטה במקום בליעת raw. פרקטיקה זו ממזערת את השגיאות המשויכות תנודות עוצמת מקור האור.
- לבצע את הניתוח הראשון מדגם בהיעדר [Ru] כדי למדוד את ההשפעה של התוספת של CaCl 2 על התגובה של התאים.
- בגין ניתוח על fluorimeter עם ההגדרות המתוארות 1.5.4. חכו כ 2 דקות כדי ליצור בסיס יציב פליטה, ולאחר מכן להוסיף µL 1.8 CaCl 2 (10 מיקרומטר ריכוז סופי). עוצמת הפליטה יגדיל מיידית על התוספת של CaCl 2 ולאחר מכן תרקב במשך דקות יוני הסידן הזנת המיטוכונדריה. המתן לסיום הריקבון (≈ 5 דקות). להוסיף בולוסים סידן נוספים כדי לקבוע את התגובה ספיגת סידן מיטוכונדריאלי של תאים לא שטופלו [Ru].
- ב cuvette אחר המכיל 5 מיקרומטר [Ru], חזור על הניסוי כמתואר לעיל ב- 1.5.4.3. בנוכחות החומר המדכא, עוצמת הפליטה להגדיל, אבל לא ריקבון. התבוננות זו מרמזת על חסם ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מתארת סינתזה של סידן מיטוכונדריאלי ספיגת מעכב [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)] Cl5 החל מ [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2, חומר המוצא ידועה ruthenium(III). [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 מאופיין ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום, עם הלטראלית ב 3200 ס מ-1, 1608 ס מ-1, 1298 ס מ-1ו- 798 ס מ-1 (איור 1). הטומאה מינור-2069 ס מ-1 ניתן לייחס Cl [Ru (NH3)5N2]3. התגובה של מין זה Ru(III) עם 1 מ' NH4או מעניק Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5. ההתקדמות של התגובה הזו שמעידים שדרשה שינוי צבע של הפתרון מצהוב לירוק. הפתרון הסופי התגובה הוא ירוק כהה בצבע. לחומצי פתרון זה עם HCl מרוכזת יוצרת שינוי צבע חום; תוצר לוואי של ניטרול הזה הוא אמוניום כלוריד, אשר יכול לזהם את המוצר הסופי, אם הטיפול לא מבוצעת. טיהור של המתחם ממשיך באמצעות כרומטוגרפיה קטיון באמצעות רשת חריפה חומצי (טופס H+ ) שרף. השרף equilibrated קודם עם 0.10 M HCl, הפתרון של Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 טעון על העמודה. לוואי אמוניום כלוריד elutes עם כביסות HCl 1 מ'. תרכובות המכילות רותניום elute בריכוזים גבוהים של HCl. סדרה של שברים צהוב, אשר מכילים unreacted [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 החל חומר, תיפרדי העמודה כאשר הריכוז HCl הוא 1.5 M. המוצר הרצוי elutes בין 2.5 – 3.0 מ' HCl, ושברים וכתוצאה מכך מופיעות ירוק עד ירוק-חום בצבע.
לפני באגירת השברים של המוצר, הטוהר צריך לאמת. כי המתחם הרצוי מוצגים כמה pH-התלות בספקטרום UV-vis שלה, אנו מציעים הוספת aliquots קטן של השברים מאוד בסיסי 3 מ', NH3 פתרונות על מנת להבטיח כי התכונות ספקטרלי זהים עבור כל השברים. שברים טהור צריך להציג רק של שיא אינטנסיבי ב 360 nm ו לשיא חלש על 600 nm (איור 2). פסגות ליד 533 ו 480 ננומטר להצביע על קיומו של רותניום חומים ואדומים, בהתאמה, ו לשיא משמעותי ב-260 nm, עם כתף-290 ננומטר, מרמז על הנוכחות של [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 החל חומר (איור 3 ). אידוי רוטרי שברים טהור מעניק למתחם הרצוי כמו מוצק ירוק-חום.
המתחם מבודד יכולים להיות מאופיינת יותר ספקטרוסקופיה UV-vis והן IR. את UV-vis קשת (איור 2) מציג ה-360 nm ולהקות 600 nm ספיגת כמתואר לעיל. המקדם הכחדה ללהקה 600 ננומטר הוא 850 מ-1ס מ-1 והוא ללהקה nm 360 מ' 27000-1ס מ-1. היחס בין עוצמת הלהקה nm 360 לעומת הלהקה 600 nm צריך להיות 31 ב- pH 7.4 PBS, מדד זה יכול לשמש ביעילות כדי לאמוד את הטוהר של המתחם. לגלים אינפרא אמור להופיע כפי שמוצג באיור4. Ru-O-Ru תדירות מתיחה, לדוגמה, הוא האבחון-850 ס מ-1. לגלים אינפרא הועסק כדי לקבוע את המתיחה Ru-O-Ru ולהבטיח שאמוניום כלוריד לא היה נוכח במוצר הסופי. אמוניום כלוריד, הטומאה נפוצים, יש הלטראלית-1762 ס מ-1 (חלש) ו- 1400 ס מ-1 (חזקה) זה מבחינים בקלות מהספקטרום IR (איור 5). רותניום אדום תוצר משותף של התגובה, ניתן לזהות ב IR ספקטרום במתיחות על 1404 ס מ-1, 1300 ס מ-1, 1037 ס מ-1 ו ס מ 800-1, למרות כמה חפיפה עם המוצר הרצוי תתרחש ( איור 6).
התגובה ספיגת סידן בתאי הלה digitonin permeabilized הוא ציין (איור 7). הכוכביות מציינות התוספת של2 CaCl מזון לעוס. בנוכחות [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)] Cl5 עלייה בעוצמת פליטה נצפית על תוספת סידן, אבל אין דעיכה עקב סידן מיטוכונדריאלי ספיגת הוא ציין.
איור 1 : ספקטרום אינפרא-אדום של [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2. ספקטרום אינפרא-אדום [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 עם הטומאה3 Cl קטן מאוד [Ru (NH3)5N2]. החץ האדום מציין את הטומאה-2,069 ס מ-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג UV-vis spectra עבור חומר טהור. [(או2) (NH3)4Ru (ממוצע-O) Ru (NH3)4(או2)] Cl5 UV-vis ספיגת ספקטרה, ליד אינפרא-אדום (פנימי) שצולמו ב- pH 7.4 PBS. המקדם הכחדה עבור ספיגת הגדולות ב 360 ננומטר הוא 27,000 מ-1 ס מ-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : ספקטרום UV-vis של תערובת התגובה גולמי. [(או2) (NH3)4Ru (ממוצע-O) Ru (NH3)4(או2)] Cl5 UV-vis ספקטרה ספיגת של תערובת התגובה גולמי לפני טיהור ב pH 7.4 PBS. החיצים האדומים מצביעים על זיהומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : נציג ספקטרום אינפרא-אדום עבור חומר טהור. ספקטרום אינפרא-אדום של Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5. המתיחה Ru-O-Ru-850 ס מ-1, מתיחות אחרים הם מן מתנדים3 מלון NH. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
/>
איור 5 : ספקטרום אינפרא-אדום המכיל NH4Cl זיהומים. ספקטרום אינפרא-אדום של Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 עם אמוניום כלוריד הטומאה. החץ האדום מציין אמוניום כלוריד ב ס 1,400 מ-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : ספקטרום אינפרא-אדום של רותניום מסחרי חא קשת אינפרא-אדום [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)] Cl5 (שחור trace) ו מסחרי רותניום אדום (אדום trace). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : תוצאות ספיגת סידן נציג. העלייה פלורסצנטיות בשל התוספת של סידן כדי קוקטייל של תאים הלה digitonin-permeabilized, סידן ירוק-5N ו- Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 ב- BGSS. הריק מכיל אין Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 , ניתן לראות ירידה פלורסצנטיות עקב Ca2 + ספיגת לתוך המיטוכונדריה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סידן מיטוכונדריאלי ספיגת מעכב [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2) Cl5 יכול להיות מסונתז מן [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2, ruthenium(III) ידועה החל חומר, כפי שמתואר בהליך זה. הסינתזה של [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 מושגת בקלות עם קושי קלה. לאחר ערבוב RuCl3 עבור 16 h ב הידרזין מימה, ה-pH של התמיסה צריך להיות מותאם לערך של 2 עם HCl. הירידה pH הוא קריטי כדי להשיג את המוצר הרצוי. אם רצונך בכך, סינתזה זו יכול לשנות צורה [Ru (NH3)5Br] Br2 refluxing ב HBr במקום HCl.
הבחנו כמה אסטרטגיות כדי למזער את היווצרות תוצרי לוואי בלתי רצויה במהלך הסינתזה של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי. ראוי לציין, לשמור את הבקבוקון הכתיר זה קריטי להצלחה של התגובה הזו; אם הבקבוק פתוח, מספר של תוצרי לוואי אחרים, לרבות רותניום אדום (RuRed), נוצרות בכמויות ניכר. ככל הנראה, גז אמוניה היא איבדה את מיכל התגובה פתוח, ואת המשקע פשרות אירוע של המוצר הרצוי. גודל הבקבוק הנפח של אמוניה מימית נמצאים גם הם פרמטרים חשובים זה צריך לא להיות שונה באופן משמעותי מאלה המתוארות פרוטוקול זה, לפי שמנו לב כי היעילות של התגובה הזו הוא ירד בצלוחיות קטנות יותר. שיטה זו אינה מגדילה באופן דרסטי את התשואה של מתחם זה לעומת אחרים שתי השיטות שאנו בעבר היה מגולה. היא, לעומת זאת, מכיל פחות שלבים, להצמיח היווצרות מוצר לוואי פחות, כגון RuRed. התשואה נמוכה לייחס את הנוכחות של כמות קטנה של unreacted [Ru (NH3)5קלרנית] Cl2 , כמו גם נודע טעונות זיהומים הנשמרות בחלק העליון של העמודה. אמנם לא בחנו את תנאי ריאקציה נוספים רבים, זה אפשרי כי שיפורים ניתן למימוש על ידי שינוי את זמן התגובה ואת ריכוז מגיבים, כדי להשיג תשואות גבוהות.
הטיהור של Cl [(או2) (NH3)4Ru Ru (ממוצע-O) (NH3)4(או2)]5 הוא חלק מייגע וקשה ביותר של פרוטוקול זה. עמודה ארוזה היטב יסייעו רבות בזמן הפירוד; טעינת את השרף slurry היא גישה יעילה לארוז את העמודה. יצוין, כי כמו ריכוז HCl גדל במהלך • תנאי עמודה, השרף מתכווצים בגודל. בהצלחה להשיג חומר טהור, הקצב שבו הוא גדל ריכוז החומצה צריך לסטות מהסדר של ההליך האמור. המוצר הסופי יהיה מוצק ירוק-חום; פתרון בסיסי יהיה ירוק כהה אך חומציים פתרונות יהיה חום. אם פתרון ורוד-אדום בהיר נצפית, רותניום אדום מציג נוכחים. כמות RuRed יכול להיקבע על-ידי שימוש המקדם הכחדה (62.000 מ-1·cm-1 -533 ננומטר). תהליך טיהור זה הוא כללי יחסית לטורים שרף קטיון חזקה.
עיכוב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי יכול להיבדק באמצעות תאים הלה permeabilized, החיישן פלורסנט סידן סידן ירוק-5N של spectrofluorimeter. 13 , 14 assay הזה דורש כמות גדולה של תאים, ולכן מחייבים הגברה של התרבות ב- 500 ס מ גדול מאוד2 פטרי. המבחנות הללו תרבות גדולים למנוע אתגרים נוספים צמצום זיהום מיקרוביאלי כי נחשפו פני שטחים גדולים במיוחד. העבודה צריכה להתבצע בזרימה שכבתית בארון כדי לשמור על עקרות. התגובה זריחה של סידן ירוק-5N בתאים הלה permeabilized מנוטרת על ידי קרינה פלואורסצנטית ספקטרוסקופיה. התוספת של בולוס חיצוני של סידן כדי cuvette מפעיל לעלייה מיידית בזריחה, הנובעים יוני הסידן אינטראקציה עם החיישן. במשך מספר דקות, בהעדר מעכב, עוצמת נרקב עקב ספיגת אלה יוני הסידן בתוך המיטוכונדריה, אברון זה לא ניתן לגשת על-ידי לצבוע. מתי זה וזמינותו מתבצע בנוכחות מעכב התוספת של סיילין יונים של סידן נותן עלייה עלייה בעוצמת פליטה. הריקבון עקב ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי, לעומת זאת, אינו נוכח, אימות המאפיינים המעכבת ספיגת סידן מיטוכונדריאלי של מתחם זה. תהליך זה יכול לשמש כמסך כללי עבור מעכבי ספיגת סידן. בנוסף, ניתן להחיל הליך זה לתאים אחרים האיקריוטים עניין. Assay הזה תלוי permeabilization החיצוני של הממברנה התאית ובכך אינו מספק מידע אודות יכולת ספיגת הסלולר קומפלקס.
לסיכום, פרוטוקול זה מתארים את סינתזה טיהור של מעכב ספיגת סידן מיטוכונדריאלי רותניום המבוסס על הרומן. המתחם הזה הוא בעל ערך משמעותי לימוד הביולוגיה של סידן מיטוכונדריאלי ותפקידו בפיזיולוגיה של בתרבית של התאים. וזמינותו פשוטה יחסית לבדיקה ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי הוא גם לשימוש הקרנה של חקירה של מעכבי חדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת קורנל. עבודה זו עשוי להשתמש במרכז קורנל עבור חומרים משותפים מכוני מחקר, אשר נתמכים באמצעות תוכנית ה-NSF MRSEC (גרנט DMR-1120296). S.R.N. מאשר תמיכה של ה-NSF בוגר מחקר לאגודה (גרנט DGE - 1650441), ד ר דייב Holowka לקבלת סיוע עם הניסויים סידן. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T.
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al.
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
