Summary
ここでデザイン、コスト、必要な設備の建設などマウス オブジェクトの位置と新規オブジェクト認識行動テストの経済的な確立のための包括的な指示を含むプロトコルを提供だけでなく行動実験、データ収集、および分析を実行します。
Abstract
Ethologically 関連行動テストは、様々 な生理学的または病理学的変化の認知的効果を研究するマウスモデルを使用する研究の重要なコンポーネントです。オブジェクトの場所のタスク (OLT)、新規オブジェクト認識タスク (水資源) 機能とメモリに関連する脳の特定領域の相対的な健康を明らかにするために一般的に使用される 2 つの効果的な行動のタスク。固有の設定を悪用これらのテストの両方のメモリを以前明らかにする目新しさはマウス発生オブジェクト、OLT は主に海馬の活動に大きく依存する空間学習を評価します。北風、対照的に、複数の脳領域に依存しているオブジェクトの識別情報の非空間学習を評価します。両方のタスクでは、オープン フィールド テストのアリーナと本質的な価値に相当するマウス、適切な環境の手がかり、ビデオ録画装置を持つオブジェクト、ソフトウェアを必要とします。市販システムは便利、高価にすることができます。この原稿は、アリーナの構築・ OLT と水資源を実行に必要な機器を設置、シンプルでコスト効果の高い手法を詳しく説明します。さらに、原稿は、OLT と水資源の両方に組み込まれ、代表的な結果と同様、データ集録および解析、典型的なメソッドを提供します効率的なテスト プロトコルについて説明します。これらのテストが正常に完了は、マウス モデルにおける記憶機能に関する貴重な洞察を提供し、これらの機能をサポートする基になる神経領域を評価できます。
Introduction
効果的な認知テストは分離し、1の制御された環境での動作を調べることによって特定の脳部位の神経の機能を評価します。ヒトでは、特定のタスクは、前頭前野の機能のタスクまたはケンブリッジの神経心理学的テスト自動化されたバッテリー (テストを学習ペアの仲間を並べ替えウィスコンシン カードなどの対象となる脳領域のパフォーマンスを評価するために設計されています。CANTAB) 海馬機能2,3。これらのテストは、それらの領域の神経活動に起因する行動を評価することによって人間の脳の特定領域の機能を研究しています。最も生物医学研究の最終目標は、人の健康の改善しかし、健康や病気で脳機能の多くの研究は、人間の参加者と倫理的実行できません。研究は人間の参加者は使用できませんが、マウスなどの小さい齧歯動物は、しばしば選択のモデルです。マウスモデルを使用して遺伝子発現の変化、損傷の誘導または光遺伝学的手法によって回路活性も変調を含む実験的操作を直接制御できます。人間テストと同様、マウスの行動テストは特定の地域に依存する挙動を測定することにより脳機能に対する実験的変数の影響を評価するために目指しています。
海馬は、人間および齧歯動物の4の記憶形成に不可欠な構造です。具体的には、海馬はリレーショナル表現を含む宣言的記憶ですが脳4モーターのセンター依存しない手続きの記憶に重要な役割を果たしています。海馬メモリ関数は、摂動に絶妙に敏感であるために、神経科学の多くの分野にまたがる研究の焦点をされています。発作と脳卒中高齢化と長期のストレスに至る負の摂動は、海馬の損傷5に関連付けられます。対照的に、社会的相互作用、物理的な環境エンリッチメント、運動などの肯定的な介入は、海馬機能6,7、8を向上させます。海馬メモリの適切なテストを持つ齧歯類での試験は、異なる環境介入の海馬の機能に及ぼす影響と同様に、メモリの細胞・分子のメディエーターに洞察力を明らかにできます。
齧歯動物、海馬依存した学習とメモリ9,10,11を研究するいくつかのテストが開発されました。彼らは広く動作の変更を引き出すために情動を伴う刺激を必要とするタスクと新しい刺激に対して11を調査する齧歯動物の嗜好に描画タスクに分割できます。恐怖による凍結挙動9,11を測定することによって環境のコンテキストおよびコンテキストのメモリで、その後テストで不愉快な刺激 (フット ショック) のペアなど文脈恐怖のエアコン。モリス水迷路とその乾燥版バーンズ迷路空間学習4,11を促進するために否定的な外部補強を使用します。それぞれのケースでは、齧歯動物は嫌悪事態、冷たい水に浸されたり、それぞれ明るいのプラットフォーム上で公開されるからの脱出を求めます。放射状迷路は対照的に、動物を使って小さな食料品報酬4,11を取得、空間記憶と相まって自然の採餌行動と肯定的な補強に依存しています。これらのタスクは、広く使用され記憶の海馬について基礎的な知識が得られています。しかし、正および負の外部の援軍やショックのような恐怖を誘発する刺激はこれらの行動に感情的なコンポーネントを追加いくつかのケースでは望ましくないかもしれないことをテストします。たとえば、背側と腹側のなったは、空間記憶の感情的な規制、それぞれ12対の異なる機能に関連付けられます。腹側海馬感情調節機能も影響を受ける場合、刺激に対する感情的な反応に依存するテストに障害空間メモリが正確に反映しない場合があります。
OLT は、海馬依存性の空間記憶13の測度を提供する簡単で効果的なテストです。タスク追加の外部補強なし目新しさ動物の本質的な好みに依存しています、したがって通常感情的な応答13による合併症を避けることができます。OLT の現在のプロトコルはマウスの提示が、装置の寸法が適切にスケーリングされる場合、それはまた、ラットにおける効果的。プロトコルはオープン フィールド テストのアリーナには、マウスを慣らすと、空間環境手がかりに関連して 2 つのオブジェクトを調査することから成っています。マウスがアリーナから削除されます、(間の間隔または ITI) 遅延、中に、オブジェクトの 1 つが移動されます。ITI 後、マウスがアリーナに再導入し、自由に探索できます。一般に、マウスは、目新しさを好む、彼らは彼らの最初の暴露からオブジェクトの位置を覚えて、もし彼らに費やす時間移動したオブジェクトを調査します。海馬病変を有する動物空間コンテキスト学習に障害があるし、その結果新規場所14,15オブジェクトのための好みを示します。
OLT は、新規オブジェクト認識タスク (水資源) 複数の脳領域から描画する神経活動にメモリの追加テストを単独または組み合わせて使用できます。北風は、オブジェクトの 1 つの新しい場所に移動する代わりに新規オブジェクトによって置き換えテスト フェーズまで、OLT と同じです。OLT の場合と同様に、オブジェクトの良い思い出を持つマウスが自発的に新規オブジェクトを調査を好みます。海馬基板を多用、オブジェクト位置メモリとは対照的物体認識のメモリは、さまざまな脳領域に依存するが表示されます、海馬の関与は決着についていません。多く海馬病変あるいは不活化に影響しないこと新規オブジェクトの好み10,13,16,17、反対18,19を見つける他のレポートを研究します。しかし、それはまだ齧歯動物で一般的なメモリ機能を評価する一般的に使用されるタスクです。
ここで提示されたプロトコルは、オープン フィールド テスト アリーナを使用した開始と OLT および水資源、実行に必要な手順を区切ります。市販の行動試験装置はコスト高く、小さい実験室のために特にすることができます。このプロトコルには、最小限のコストで、特殊な工具を使わずに社内の競技場を構築する設計と簡単な手順が含まれます。さらに、このプロトコルは、アリーナ、文脈手がかりと OLT と水資源のプロトコルの実装のための段階を設定するビデオ録画システムの配置を含む理想的な行動のテスト領域を詳しく説明します。すべての材料と試験手順の最適化の重要性を強調し、成功として欠陥のある研究の代表的な結果が掲載されています。
| 説明 | オプション | 数量 |
| パート a: アクリル シート - 不透明な白 (0.635 cm x 40 cm x 40.64 cm) | ルーティングされたエッジ | 2 |
| パート b: アクリル シート - 不透明な白 (0.635 cm × 40 cm × 41.91 cm) | ルーティングされたエッジ | 2 |
| パート c: アクリル シート - 不透明な白 (0.635 cm × 41.91 cm × 41.91 cm) | ルーティングされたエッジ | 1 |
| アクリル セメント (1 pt) | NA | 1 |
| 16 ゲージ ハイポ アプリケータ | NA | 1 |
| スコヤ | NA | 1 |
| HD ウェブカメラ | NA | 1 |
| ビデオ キャプチャ ソフトウェア | NA | 1 |
| USB 2.0 延長ケーブル | NA | 1 |
| ケーブル電線管 | NA | 1 |
表 1: 行動テストに必要な機材の明細リスト。
Protocol
次のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) オハイオ州州立大学 (OSU) でによって承認されています。
1. アリーナの構築
- 表 1に記載されている資料を注文: 5 枚アクリル ・ アクリル セメント ・ 16 G のハイポ アプリケーター。
- 目、皮膚、およびその他の種類の保護を含めることができます製造元の指示に従って適切な安全装備を着用してください。
- アクリル シートの保護紙コーティングを削除します。
- ドライ フィット サイズが正しい (図 1 a) であることを確認するすべての材料です。
- 組み立てるし、アクリル セメントをシリンジを読み込みます。
- ベース (パーツ C) の上端を外の壁 (B) の長い方の端に合わせ、組み合わせまたは機械工広場を使用して互いに垂直になります。
- 注射器を使用すると、結合される 2 つの部分の角に直接セメントの小さい、安定したビードを適用します。
- (約 5 分) を最初に設定されるまで保留 2 つの場所で (パーツ B と C) の部分します。
注: 通常、彼らは 80%、24 時間で硬化になりますが、アセンブリは、5 分後に続けることができます。 - 同じベースに外壁 (一部 B) 手順 1.5-1.7 を繰り返します。
- 手順 1.5-1.7 を使用してベースに 1 つずつ、2 つ内側壁 (Part A) を添付します。
- さらに、シリンジを使用して小さなを適用と直接セメントの安定したビード今 (B) の外の壁と内側によって形成されているコーナーに壁 (Part A)。
- 5 分のための場所のこれらの部分を保持します。
- 24-48 時間後行動のテスト環境のセットアップに進みます。
2. 行動のテスト環境、機器の設定
- (前述の説明で) 互いとバトルエリア (図 1 b) でアリーナに直面して向かい環境手がかりを配置します。
- 2 によって 2 方法床や手がかりと視覚入力マウス (図 1 b) を最大化するカメラから適切な距離に丈夫なテーブルのいずれかで 4 つのテスト アリーナを配置します。
- アリーナと手がかりの間のこれらの距離が適切であることを確認する手がかりに向かって壁を越えて各アリーナの床から支えメートルの棒を使用して視力の行を確認します。
- カメラの高さとテーブルの高さを調整することによってすべての 4 つのアリーナのビデオ マニュアルを可能にする最適な光路長を決定します。(図 1 b)。
- カメラを USB 延長ケーブルに接続します。
- ケーブル配線管を使用して、天井にケーブルを実行し、ビデオを実行しているコンピューターに壁をソフトウェアをキャプチャします。
- 研究員 (図 1) からテストの領域でマウスを分けるカーテンの背後にあるコンピューターを非表示には。
- 4 各約 2-5 cm の長さと幅は、少なくとも 3 の別のオブジェクトを組み立てる (図 1) をテストするために使用する高さで 10 cm まで。
図 1: 行動のテスト準備します。(A) オープン フィールド テスト内壁、外壁、として部分 B とベースとして部分 C に対応するパート A とアリーナ アセンブリ。ベースのエッジ全体を実行する 2 つの外側壁 (B パーツ) とベース (パーツ C) の隣接するエッジの外側の壁の間に合わせて 2 つの内部壁 (パーツ A) 完成したアリーナがあります。すべての壁がベースの上に残りの部分します。(B) 0.62 m 高いテーブル、60 × 90 cm 環境手がかり、ライト、およびすべての 4 つのアリーナのキャプチャを同時に実行できるテスト領域のカメラのアリーナの代表的な配置。(C) A のカーテンは、試験中にマウスから実験者とコンピューター システムを隠します。天井の照明は、この撮影のために、テスト中に床ランプのみがあります。また、環境の手がかりの一つはテストの領域のこの写真は取り外されたが、テスト中に、テーブルの後ろにすべての黒のキューに直面して、アリーナの前に第 4 手掛かりが。(D) の代表的なオブジェクト (およびスケールの定規) OLT や水資源のマウスとテストのために適切です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
- これらのオブジェクトを検証します。
- 使用される実験的マウスのセックス、ひずみ、および年齢別グループの代表者の 8 の野生型マウスの最小値を取得 (例えば、 9 週齢女性と男性 c57bl/6 マウスに 6)。
- テストの前に 3-5 日間のコース上の 1 分の毎日のすべてのマウスを処理します。
- マウスを 4 つのグループに分割し、既に単独で収容されない場合きれいなケージを持って個々 に移動します。
- テストの部屋にそれらをもたらす、少なくとも 30 分順応させることができます。
注: これらの 30 分のための部屋の実験者の存在は実験者が男性20の場合特にタスク中にマウスにストレスが軽減されます。 - 馴化に行われ、実験者を開始する準備ができて後、は、録画を開始します。
- (リリース コーナーと呼ばれる) アリーナの一角の壁に直面している各マウスを置きます (図 2 a)。
- 10 分間自由にアリーナを探索するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- 20 分の持続期間のための彼らの清潔保持ケージに戻りマウス。
- きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄方法、次に使う前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどをお勧めします。
- 両面テープを使用すると、オブジェクトは 6 × 6 cm2 (図 2 b) 角の各壁からアリーナで相殺したその 2 非リリース コーナーの近く 2 つの異なるオブジェクトに貼付します。
- ビデオの記録を開始します。
- リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
- アリーナと 10 分間自由にオブジェクトを調査するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- 場所マウスは 20 分の持続期間のための清潔保持檻の中でバックアップします。
- きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
- 2 新しいオブジェクトすべてのオブジェクト (少なくとも 3 つ異なるオブジェクト OLT と水資源の両方を行う場合) は、それぞれマウスでテストされているまで同じ場所に貼付、訓練試験を繰り返します。
- マウスをオブジェクトの上に座ることができるオブジェクトを除外します。
- 手順 4 に従って、各オブジェクトをそれぞれのマウスの調査時間を分析します。
- 正または負の固有値を持つオブジェクトを除外します。
3. 行動テストの実施
- 試験前 1 週間: 個人行動テストの実施の周知
- 9 週齢女性と男性 c57bl/6 マウス試験前に 3-5 日間のコース上の 1 分の毎日に大人 6 を処理します。
- 1 日目: 慣れセッション
- マウスを 4 つのグループに分割し、既に単独で収容されない場合きれいなケージを持って個々 に移動します。
- テストの部屋にそれらをもたらすと、少なくとも 30 分の試験会場に慣れることができます。
注:これらの 30 分のための部屋の実験者の存在は、実験者が男性20の場合特にタスク中にマウスのストレスが軽減されます。
- 馴化に行われ、実験者を開始する準備ができて後、は、録画を開始します。
- アリーナ (アリーナあたり 1 つのマウス) の各マウスを置きます (図 2 a) リリース コーナーの壁に直面しています。
- 6 分間自由にアリーナを探索するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- (ITI) の間の間隔の間にきれいな持株檻にマウスを戻ります。
- きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をお勧めします。
- 各マウスの 3 慣れセッションの合計の手順 3.3 – 3.9 2 回を繰り返します。
- すべてのマウスを彼らの家のケージに戻ります。
- きれいな動物施設とすべての競技は、洗浄翌日に使用前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をお勧めします。
- 2 日目: 訓練試験、OLT の水資源
注: 北風はオプションのテストです。- 24 h 後テスト部屋にマウスの同じグループを持って来ると少なくとも 30 分前の日に慣れセッション前に、と試験会場に慣れることができます。
- 2 オブジェクト (図 2 b) アリーナに配置されますを使用しての訓練試験を実施します。
- 両面テープを使用して、彼らは分野で相殺、その 2 非リリース コーナーからオブジェクト 6 × 6 cm2に貼付します。
- ビデオの記録を開始します。
- リリース コーナーの壁に直面して慣れセッションの間に実行される各マウスを置きます。
- アリーナと 10 分間自由にオブジェクトを調査するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- 場所マウスは、20 分の ITI の清潔保持檻の中でバックアップします。
- きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
- OLT を実行します。
- 新しい非リリース コーナーに試用の訓練で使用されるオブジェクトの 1 つを移動し、オブジェクトの両面テープ (図 2) でそのコーナーの各壁から 6 cm を押さなければ。
注: 他のオブジェクトは、トライアル トレーニング中だったままする必要があります。 - ビデオの記録を開始します。
- リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
- 10 分間オブジェクトを調査するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- 場所マウスは、20 分の ITI の清潔保持檻の中でバックアップします。
- きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
- 新しい非リリース コーナーに試用の訓練で使用されるオブジェクトの 1 つを移動し、オブジェクトの両面テープ (図 2) でそのコーナーの各壁から 6 cm を押さなければ。
- 北風を実行します。
- 新規オブジェクトに OLT の中に移動されたオブジェクトを置き換えるし、貼る両面テープ (図 2 D) で隅の 2 つの壁から 6 cm の新規のオブジェクト。
- ビデオの記録を開始します。
- リリース コーナーの壁に直面している各マウスを置きます。
- 10 分間オブジェクトを調査するマウスを許可します。
- 録画を停止します。
- 自分のホームケージでマウスを配置します。
- きれいなすべてのアリーナ、動物実験施設を持つオブジェクトは、次の使用前に嗅覚手がかりを最小限に抑えるための 70% のエタノールで拭くなどの方法をクリーニングすることをお勧めします。
図 2: 試験のためアリーナ構成します。(A) オープン フィールド テスト慣れセッション オブジェクトを持たないアリーナ。黒い矢印は、リリース コーナーを示します。このコーナー各アリーナで同じ相対的な位置、テストされているすべてのマウスと毎回毎回一貫しています。(B) トレーニング試験 2 つの異なるオブジェクトが、それぞれ壁から 6 × 6 cm のオープン フィールドにセキュリティで保護されています。(C) ため、OLT の 1 つのオブジェクトは、新しい場所、壁やリリース コーナーないからまた 6 × 6 cm に移動されます。OLT から移動したオブジェクトは今よく知られた目的、(D) のための水資源、OLT に固定されたオブジェクトが新規オブジェクトに置き換えられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
4. 行動テスト データの分析
注: ビデオの分析は、少なくとも 2 つの独立した、盲目の実験者によって理想的に完了する必要があります。
- ビデオ ファイルを開きます。
- 活発な調査を決定するための画面上の各オブジェクトの周囲 2 cm の枠を提供する透明な円を適用します。アリーナは、定規でビデオ ファイル イメージを使用すると、このグリッドを調整します。
- マウスの行動を観察してマウスが積極的に 2 cm の最大距離でオブジェクトをそのオブジェクトから先のとがった鼻から成っているオブジェクトを調査した時刻を記録します。
- レコード タイムスタンプ マウスは、そのオブジェクトの調査を停止するときにオブジェクトとタイム ・ スタンプを調査を開始します。
- 試験の持続期間のためアリーナで両方のオブジェクトのこの手順を繰り返します。
- マウスがオブジェクト調査の各インスタンスの停止時刻から開始時刻を減算することとすべてのそれらの値を追加することによって各オブジェクトを調査した累積時間を計算します。
- 合計調査時間や次の数式を使用して差別インデックスの % を計算します。
- 合計調査時間の % の計算 =
注: 50% を超える値は、新規の場所またはオブジェクトのより大きい調査を示します。 - 差別インデックスの計算 =
注: 正の値は、新規オブジェクトを調査するより多くの時間を示します。ゼロの差別インデックスは、両方のオブジェクトと等しい時間を示します。
- 合計調査時間の % の計算 =
- 結果と比較されるグループの数に応じて、t 検定や分散分析を使用して完全な統計分析をグラフィカルに表現します。
Representative Results
図 3は、男性と女性のアダルト c57bl/6 マウスこのプロトコル6を使用してにより得られた典型的な肯定的な否定的な結果の例を示します。グループのデータを集計する常に OLT と水資源データの解釈が適用されます (以下の説明を参照してください)。単一のマウスの調査時間は、メモリまたはメモリの不足として解釈できません。ただし、マウスのグループのパフォーマンス (すなわち。、複数のサンプル) 他のグループ、または統計的検定を用いた固定チャンス レベルに比較することができます。典型的な研修試用期間中にマウスのグループを表示しない重要な好み平均オブジェクトのいずれかと同様に小説も (図 3 aと3 b) マウスに任意の本質的に負または正の値を持っていません。マウスのグループのデータを集計は、トレーニング中に別のオブジェクトを 1 つの重要な選好を示す場合、その固有の好み/嫌悪感は後続の試験で結果を混乱させるためはこれらオブジェクトを使用できませんする必要があります。また、すべてのマウスの合計調査の時間は、最低基準を満たす必要があります (20 秒21で伝統的に設定) とメモリの後続のテストに影響を与える調査で基準の違いがないことを確認して比較する必要があります。
OLT の中にオブジェクトの場所のためのメモリは、マウス移動したオブジェクト (図 3 a) と総調査時間の 50% 以上の大きな支出の平均に反映されます。個々 のマウスの合計調査時間が大きく異なる場合は結果、オブジェクト (図 3 b) の差別インデックスとして描かれています。図 3Bの平均差別インデックスの大幅な増加に移った後にマウスがオブジェクトに多くの時間を過ごしたことを示します。時間の割合または差別インデックスの増加によって測定されるかどうか、オブジェクトが移動された後の調査では増加はマウスがオブジェクトが訓練の間に位置していた場所を覚えていること示唆しています。
このプロトコルの最後の試みは、物体認識のメモリを評価します。マウスの 1 つのグループの代表的な例は、肯定的な差別インデックス (図 3 D) がそれぞれ 50% と 0 の固定のコントロールの値と比較して、調査時間 (図 3) の平均割合を示します。として OLT データと個々 のマウス間総調査の時間に有意な変動がある場合差別インデックスがこのデータを視覚化するより良い方法。図 3Eは北風と (説明参照) これらのテストで発生する可能性合併症の統計のいくつかの 2 群比較の例を示します。グループ B の 1 サンプルの t 検定では、50% を大幅に上回る調査を示しています、同じテストをグループ A は行わない。この発見は、A と B がお互いから異なっていることを意味しません。グループの違いを決定する、A をグループ B を比較する独立した 2 標本ノンパラ マンホイットニー検定を実行する必要があります。このグループの代表的なデータの 2 つの標本ノンパラ マンホイットニー検定の大きな違いを示します (p = 0.66) 新規オブジェクト調査時間の割合で 2 つのグループの間。
OLT と水資源がオブジェクトの本質的な価値に非常に敏感と結果を混同することが本質的なバイアスがないことを確認する必要があるオブジェクトの等価性のテストします。図 3 fと3 Gは、不適切なオブジェクトの選択の例を示します。4 のサンプル サイズとパイロット テストでは、マウスは、オブジェクト A はオブジェクト B (図 3 f) と対になってときと調査時間の 50% 未満の支出傾向を示した。これらのオブジェクトは、新しいオブジェクトおよび 16 の大きなサンプル サイズとしてオブジェクト A と水資源の使用された、マウスはよりかなり低い時間の 50% 調査オブジェクト A と (図 3) を過ごした。新規オブジェクトにこの嫌悪感は簡単に認識できるここでは実験の技術的な欠陥としてオブジェクト固有設定/回避のためのパイロット テストが不可欠である理由を例証。
図 3: 野生型アダルト c57bl/6 マウスの行動テスト データ。(A) 調査の結果、オブジェクトが移動された後の OLT ショーの大幅な増加とトライアルのトレーニング中に移動されたオブジェクトの % の合計調査時間の比較。p < 0.0001、t 検定。(B) トレーニングおよび差別インデックスとして表示されます OLT 試験中に移動されたオブジェクト調査のため代表的な結果は、同様に移動後オブジェクトの調査で有意な増加を示すp < 0.0001、t 検定。北風の新規オブジェクトの (C) パーセントの合計調査時は、新規オブジェクトを調査するための重要な設定を示しています。* * p = 0.0024、1 標本 t 検定対。50%。(D) 代表は、識別指数は同様に新規オブジェクトを調査するための好みを示す表示水資源の新規オブジェクト調査の結果します。* * p = 0.0024、1 標本 t 検定対0。(E) マウスの 2 つの異なるグループを含む水資源分析の代表的な結果。グループ B は 1 標本 t 検定によって 50% と大きく異なる (* * p = 0.0024)、グループ A はしていません (p = 0.5837)。分離解析グループを比較する 2 サンプル マンホイットニー検定される不均一なグループのサイズのため、調査に大きな違いが見つからない場合 (p = 0.66、ns)。(F) オブジェクトをサイズの小さいサンプルで検証試験中の時間の割合は、オブジェクトへの嫌悪の傾向を示しています。p = 0.2159、1 サンプルの t テスト。(G) 新規オブジェクトで、サンプル サイズを大きくと、水資源の新規オブジェクトとして使用 (F) からオブジェクト、オブジェクトに大きな嫌悪感が発見です。* p = 0.0270、1 サンプルの t テスト。これは、オブジェクトの選択の技術的な失敗の例です。± SEM. データ C E は前の文書6から合わせられるパネルからの意味、データが掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、オブジェクトの場所と新しいオブジェクト認識行動マウスのテストを実施するコスト効果の高い方法を提供します。これらのテストは、海馬の機能だけでなく、オブジェクト認識10に関与する前頭前野など他の皮質の機能の評価を有効にします。OLT と水資源モリス水迷路、文脈恐怖条件付け、バーンズ迷路または放射状迷路に必要な強い情動刺激を避ける利点があります。彼らはまた放射状迷路に必要な絶食の必要性を避けます。さらに、このプロトコルは、実行または分析の広範なまたは複雑な機器を必要としない単純な 2 日間のテスト手順について説明します。これらのタスクの 1 つの欠点は、彼らが学習や買収の対策のため許可しないことです。新規性調査の違い可能性がありますオブジェクトについて貧しい学習訓練、貧しい学んだのメモリまたは両方。探査車の本質的な違いを排除の重要な測定オブジェクトを調査に要した合計時間ですが学習の測定ではありません。学習の対策が実験的質問、水迷路、バーンズ迷路の重要な放射状迷路は望ましいだろうか。
行動のアリーナのカスタム建物数百ドルを保存し、さまざまな研究所の手の届かない以内にテスト オブジェクトをもたらす可能性があります。このプロトコルは、多くの障害を排除し、アクリルで社内アリーナ建設をより専門的なトレーニングなしで科学者にアクセスできるように作製プロセスを合理化します。それは、マウス、マウスの黒白いアクリルなど白いマウスの黒のアクリルとは対照的に色のアクリル シートを購入容易になりますデータ集録および解析、特に市販使用するときに注意することが重要解析ソフトウェア。(表 1) を見て注文「エッジ ルーティング」とカット-サイズのシートでは、テーブルが不要となっています。、アクリル セメント ドリルし、皿パイロット穴する必要があります。休憩、チップとその脆い性質のため亀裂がしばしばファスナー、穴あけ加工、アクリル板のカッティングでねじ込みます。セメントは、溶媒は、それが結合する領域に流れます、溶解・軟化、アクリルが発生しました。したがって、それに加わらない各部分別に伝統的な接着剤であるかのよう。接着剤とは異なり、セメントはない負のスペースを埋めるか、表面に付着。これは、これは多くのより良い結合を作成する、滑らかでフラット エッジを確保する「ルーティング エッジ」を注文する主な理由です。セメントが乾くと、「溶剤溶接」と呼ばれるプロセスで 1 つの作品に 2 つのアクリル シート融合いるそれは。金属の溶接と同様完成品は一枚が、溶接部が常に弱い場所。そのため、アリーナが使用されたら、注意は直接的な影響またはこれらの局面で極度のストレスを避けるためにすべき。
このプロトコルはまた 4 アリーナ (図 1および図 2) 最大 4 マウスの同時テストをセットアップする方法を示しています。アリーナの不透明な壁は、テスト中に、別の 1 つを見てからマウスを防ぐが、部屋で他のマウスを持っている臭気を引き起こす可能性またはテストを損なうことができるノイズの気晴らしはまだ。慣れ試験詳細ここですることができますは、マウスが行動テスト前に動物多室条件に公開されてこの懸念を軽減できます。しかし、もし気晴らし他マウスまたは実験者から他のマウスの処理に関連付けられているノイズは強い懸念、1 つのマウスと 1 つのアリーナも使用できる、同様に、複数のマウスで、OLT と水資源を完了するために必要な時間が増えます。以上 4 アリーナは、同様に、理論的には使用できるが、ほとんどのカメラは、良好な解像度、多くのアリーナを表示する十分な幅フィールドのビューを持っていません。
寸法と距離を提供、寸法 (図 1 bと1 C) 16 m3 x 16 x 16 は、典型的な実験室のマウス行動実験のための一般的なガイドラインを示します。適切な環境手がかりのセットアップ、アリーナ、そしてビデオ録画装置を環境ごとに最適化されなければなりません。手がかりは、大規模な図形や空間、OLT の間に彼ら自身を方向づけるためにネズミを有効にする (通常は黒と白のパターンで構成できます。手がかりは、代わりにお互いの向かいに別の場所で合図を配置する、テスト領域の壁にマウントできます。このプロトコルでは、行動テスト中に研究者とコンピューターを非表示にするカーテン テストの部屋の分割をお勧めします。すべての慣れ、間の間隔、およびアクティブな試験、中に研究者は、テスト領域から自分自身を分離するカーテンを閉じる必要があります。これは実用的ではありません、コンピューターがマウスの観点から残ることができるが、研究者はビューからタスクの間に移動する必要があります。研究者が存在する場合、マウスが空間手がかりとして、彼女または彼に依存しようとします。
すべて行動テストは、約 310 ルクスと実験者に香水などの不要なサウンドまたは強い環境臭いキューで薄暗く、でも照明と温度と湿度制御環境で完了する必要があります。各試験と試験日までの間すべてのアリーナ、オブジェクトは、嗅覚の手がかりを最小限に抑える動物実験施設殺菌ワイプの 70% のエタノールまたは香りの漂白剤で拭くなどの方法をお勧めしますで洗浄する必要があります。化学消毒剤を使用する場合 70% エタノールで最終すすぎは多くの化学消毒剤は動物の足を刺激することができますのでお勧めします。 OLT と水資源を実行、20,22のテスト中にストレスを減らす、人とそれらを理解する必要があるテスト前に数日間マウスを処理、行動のタスクと同様に。マウス試験会場近くのなじみのない個人による急性ストレスを経験することができます、同じ人物によってすべて行動テストを完了する必要があることをもお勧めします。テストのパラメーターと条件このプロトコルで 9 週齢アダルト c57bl/6 マウスに 6 に最適化されています、明らかにこの年齢層の損傷による記憶障害で最も役に立つだろうまたはによる記憶障害は、古いマウスの自体を年齢します。目的が若齢マウスのメモリの改善をテストする場合は、1 時間から 1 日まで長い ITI は天井簡単に 20 分 ITI バージョンのパフォーマンスに影響を回避するより適切でしょう。確かに、ITIs の範囲 (即時のリコール) の 5 分から数時間または数日間 (リモート記憶)、実験と菌株の特定のニーズやマウスの年齢に応じてです。重要なは、長さにかかわらずすべて ITIs は、実験ではセッション間で一貫してはずです。行動と学習、テスト領域の配置、間隔、各審判のタイミングの違いを展示異なる系統とマウスの週齢とマウス、彼らの年齢、および特定の損傷の特定の歪みによると使用されているオブジェクトを変更できる/病気/介入モデル対象9,21,23,25。
空間記憶機能の海馬依存性のテスト、OLT は定評、北風は、海馬に依存しないこと。北風からデータの解釈は、アカウントにでこの警告を取る必要があります。物体認識のメモリの海馬が関係するかの決定変数はまだ、時に合意されていませんが、ITI 長さまたは空間的な手がかり18の顕著性を含めることができます。特に、提案するプロトコルは、北風で海馬のプロセスを使用してに向かってマウスをバイアスが、北風の前に空間の OLT を使用します。したがって、順序を逆にすることができます、または実験者の質問やニーズに応じて各タスクを独立して実行できることに注意する重要です。
オブジェクトの選択は、OLT と水資源の22,24の重要な側面です。理想的なオブジェクトは、簡単にマウスで避難され、ガラスや金属、咀嚼や傷によるダメージをマウスのような素材には十分に重い。木製、泡、または柔らかいプラスチック製のオブジェクトは適していませんと変形が簡単に無臭を維持が難しいです。さらに、試験で使用されるオブジェクトすべてのようになります比較的サイズ、テクスチャー、香り、素材で。図 1は、使用できる適切なオブジェクトの例を示します。ひよこのこのオレンジのプラスチック置物はそれに十分な重量を与えるために砂でいっぱい、洗浄試薬または他の臭気の原因となるエージェントの漏れを防ぐために密封します。上部の形状、ためは、マウスがの上に登るまたはこのオブジェクトの上に座ることができます。OLT の水資源、このオブジェクトは似たようなサイズ、重量、素材、色、ウサギのようなプラスチック置物などの複雑さの別のオブジェクトとコーディネートしています。オブジェクト調査は本当に目新しさのための好みを反映して、同じ系統で 8 マウスの最小値と同等の本質的な価値のすべてのオブジェクトを検証する必要がありますように、セックスと実験的グループとしての年齢は、プロトコルのセクション 2.9 で説明します。さらに、さらにオブジェクトの固有の特性もない好みに影響を与えているように同じ研究ではマウスの間小説または移動したオブジェクトは、オブジェクトの面でランダムにオブジェクトをする必要があります。オブジェクトの配置はできます OLT と水資源の成否にも大きく影響します。オブジェクトは、アリーナで相殺して、壁に近すぎるではない必要があります。オブジェクトによって混雑コーナーに非表示にマウスのための魅力的な場所である、これは調査の対策が混同されます。
マウスがオブジェクトで先のとがった鼻とオブジェクトを従事するときは、「アクティブな調査」を定義しているデータ コレクションに重要な前提条件以上 2 cm 離れて。マウスをオブジェクトの上に移動したり、後のオブジェクトを超えて探している活発な調査として対象となりません。さらに、OLT と水資源に依存マウスの空間的位置やオブジェクトの実際の機能のいずれかを思い出し、訓練試験中に、これらの十分な検討が必要があります。したがって、研究者最低調査時間を定義し、調査、伝統的に 20 秒21でのベースライン レベルを満たしていない科目を除外します。
オブジェクト調査時間の定量化は、さまざまな方法でまたは高価な分析ソフトウェアを使用せずに実現できます。マニュアル スコア リングが使用されている前述のように、最も包括的なデータ収集が、マウスがオブジェクトを調査するときにビデオのタイムスタンプを記録することによって実現できます。公平なタイムスタンプの永続的なログを作成してオブジェクト調査 3 つの個々 の試験時の起動・停止時間を記録とのストップウォッチを使用するなどの方法ではなくデータの正確な手動計算が容易になります相加的マウス各オブジェクトを調査する時間の合計を記録します。
オブジェクト調査をスコアリングのための商用ソフトウェア パッケージも承ります。市販のソフトウェアは、手採点の総距離を含むここに記載されているデータ以外のデータの富を旅して、アリーナの特定の領域と運動16,23のスピードで費やされた時間数を提供できます。ソフトウェアは、適切に校正し、マニュアル スコア リングよりもはるかに高速データももたらすことができるオブジェクト調査を確実に検出することが確認します。この高速データ収量では、手動スコアリングに必要な人間の時間と比較してコスト削減をもたらす可能性があります、長い目で見れば。しかし、行動の分析のためのほとんどのソフトウェア パッケージがあることができる多くのラボの法外な高の先行コスト、マニュアル スコア リング頻繁、学生研究員、行動得点の時間コストを最小限に作ることで実現できます。商用ソフトウェアは頻繁にまたデータ スループットと時間の節約を制限する同時にソフトウェアにアクセスできるユーザー数の制限と来る。これらのソフトウェア パッケージに多くの利点がある、彼らは OLT と水資源からオブジェクトを調べるのに時間の重要な情報を収集する必要はありません。手動でこのデータを取得する機能は、幅広い研究者より経済的にアクセス新規オブジェクトのタスクになります。
このプロトコルの追加機能は慣れの最初のセッション活動と不安のレベルに関するデータを得ることができる開いた分野で本質的に裁判であります。活動レベルは旅の総距離を用いて定量化することができます。 または平均速度、トラッキング ソフトウェアが利用可能な場合。同様に、ソフトウェアの追跡、不安対策はアリーナや中心距離の中心で費やされた時間から派生できます。これらのデータは、グリッドをアリーナのビデオに重ねること、踏切を定量化して手動で取得できます。このオープン フィールド データが総運動障害や過度の不安オブジェクト調査後で干渉する可能性を排除できます。
このプロトコルで使われる統計テストは、分析の従来の代表です。マウスの 2 つのグループを比較すると、グループ間移動または新規のオブジェクトの調査の時間の割合の違いの重要性をテストする 2 サンプル、両側 t 検定お勧め。サンプル サイズが均一でない場合は、ばらつきが非常に大きい、または非パラメトリック テスト代わりにお勧め、t 検定の前提の多くにこれらの条件に違反するが、グループ間で不均一な変動を示します。マウスの 3 つ以上のグループを比較すると、性をグループに移動した、または新規のオブジェクトの調査の時間の割合に影響するかどうかをテストするのには推奨します。エラー修正の事後テスト、テューキー テストまたはペアワイズ比較、ボンフェローニ修正は、グループの各ペア間のパーセントの調査時間の差をテストするのには、適用できるようします。OLT のデータを分析する付加的な方法が、OLT 試験トレーニングから移動したオブジェクトを調査の時間の割合に大きな変化をテストします。マウスの 1 つのグループ、このテスト対、両側 t 検定、各マウスに OLT にトレーニングから移動したオブジェクトとの時間の割合で重要な変更のテストの形式がかかるだろう (ペア分析にこれらは、心に留めておくと独立していません。各マウスは、2 つのデータ ポイントを得られますので測定)。繰り返しの測定でマウス使用する双方向の分散分析反復測定の 2 つのグループ裁判 (トレーニング OLT 対) と 2 番目の要素のグループ割り当てされています。治療群間の差は事後テストは、試験内で互いにグループを比べるべきです。
また、OLT または水資源で記憶の証拠は、テストされているすべては、50% の固定値とオブジェクトの調査の時間の割合の 1 サンプルの t 検定が使用できます。時間の割合 50% より有意に高いでは、オブジェクトのメモリを示唆しています。50% 以下大幅時間の割合 (理由) は、嫌悪感を示しているし、オブジェクトの選択を再評価する必要があります。ただし、1 標本の t 検定 2 つ以上のグループが互いに異なるかどうかを明らかにすることはできません。たとえば、マウス、グループ A は p の新規オブジェクトに時間の 60% を使った場合の 2 つのグループの実験で 50%、B 群 0.049 で 1 サンプルの t テスト比較を = p の 59% の新規オブジェクトに時間を過ごしただけ = 0.051、グループ A は 50% と大幅に異なる (およびグループ B ではない)。ただし、それはこれらの 2 つのグループは互いと大幅に異なる結論に誤りです。2 サンプルの t テスト比較する A と B がこれらの 2 つのグループは統計的に区別されないについて明らかにする簡単にすることができます。最終的な目標は、2 つ以上のグループのメモリのパフォーマンスを比較することは、それらのグループは、外部標準と比較してだけではなく、お互いに統計的に比較する必要があります。トレーニングと OLT の間移動したオブジェクトと一緒に過ごした時間の比較のために同様のガイドラインが適用されます。この場合、トレーニングと OLT の移動したオブジェクトとの時間の割合で重要な違いを見つけることとは別の 1 つのグループで表示されませんこれらのグループが統計学的に異なっています。グループは、事後だけでなく複数のグループ内試験各試験内でお互いと比較をする必要があります。
任意の個々 のマウスの調査時間は、メモリについてのエビデンスとして使用できません注意してくださいすることが重要です。むしろ、メモリ オブジェクトの場所またはこれらのタスクの id のみ判断できますは別のグループの集計データまたは固定チャンス レベル (50 時間、弁別比 0%) と比較して統計的に集計データに基づいて。サンプル サイズは、特定の操作と動作は、どちらの順番によって異なります使用されているマウスの可変性の効果サイズ大きく依存が必要があります。年齢、性別、および操作の変動に影響を与えるすべての。図 3 a 3 b、n で提示された例のデータで 14 = 0.65 α と対 t 検定の 0.68 の効果サイズそして力を降伏、被験者が使用された = 0.05。この比較のため 0.8 の力が求められ、18 のサンプル サイズが必要になります。
この議論は、p 値の周りフレームと意義ヒューズこれらは最も一般にメジャーと解析ので OLT と水資源データに関する報告したがって、実験者と校閲者の両方に精通することは。この p 値依存は、統計的に無効な26として強く批判されています。ただし、代替分析法は存在し、いくつかのジャーナル27で推奨している、けれどもどれも広くとして採用されています行動および生物医学の分野で標準的な26。
要約すると、このプロトコルは効果的に最小限のコストでマウスのメモリをテストします。プロトコルに適切な修正のための推薦はあらゆる小さい齧歯動物モデルと実装の成功を確保するために含まれます。このプロトコルの特定のけがや治療的介入モデルへの応用が研究されている細胞および分子メカニズムを補完する貴重な機能的関連性を明らかにできます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH から R00 NS089938、EDK に慢性脳損傷とオハイオ州立大学での探索テーマから資金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 15.75" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 15.75" x 16.5" with Routed Edges |
| Sign White - 9% Translucent and Opaque Colored Cast Acrylic (Chemcast) | TAP Plastics | NA | 1/4" x 16.5" x 16.5" with Routed Edges |
| TAP Acryllic Cement (1 pt.) | TAP Plastics | NA | |
| 16 G Hypo Applicator | TAP Plastics | NA | |
| Debut Video Capture Software Pro Edition | NCH Software | NA | |
| Stanely SAE/Metric Comb Square | Grainger | 6R171 | |
| Logitech Pro Stream Webcam C922x | CDW | 4429927 | |
| Belkin 16' USB 2.0 Active Extension Cable | CDW | 570691 | |
| Panduit Pan-Way LD Surface Raceway (8') | CDW | 300902 | |
| Spatial/Environmental Cues | Variable | NA | |
| Objects for testing | Variable | NA | |
| 70% ethanol | Variable | NA | |
| Double-sided tape | Variable | NA |
References
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