Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

Мы разработали модель хориоамнионит для имитации воздействия плода на воспаление матери (ФЕМИ) без осложнений живых организмов для изучения влияния ФЕМИ на развитие желудочно-кишечного тракта потомства. Это позволяет изучать механистические причины развития кишечной травмы после хориоамнионит.

Abstract

Хориоамнионит является распространенным осадком преждевременных родов и связан со многими из заболеваний недоношенных, в том числе некротизирующий энтероколит (NEC). Однако механистическая связь между этими двумя условиями еще предстоит выяснить. Мы приняли мурин модель хориоамнионит с участием липополисахарид (LPS)-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (FEMI). Эта модель FEMI вызывает стерильный материнский, плацентарный и плода воспалительный каскад, который также присутствует во многих случаях клинического хориоамнионит. Хотя существуют модели, которые используют живые бактерии и более точно имитируют патофизиологию восходящей инфекции, приводящей к хориоамниониту, эти методы могут вызвать косвенное воздействие на развитие незрелого желудочно-кишечного тракта и связанного с ним развивающегося микробиома. Используя этот протокол, мы продемонстрировали, что ИНДУЦ, вызванный LPS FEMI, приводит к дозозависимым увеличению потери беременности и преждевременных родов, а также нарушению нормального развития кишечника у потомства. Кроме того, мы показали, что FEMI значительно увеличивает кишечные травмы и цитокины сыворотки у потомства, одновременно уменьшая кубок и клетки Панета, которые обеспечивают первую линию врожденного иммунитета против воспаления кишечника. Хотя аналогичная модель LPS-индуцированной FEMI была использована для моделирования связи между хориоамнионитом и последующими аномалиями центральной нервной системы, насколько нам известно, этот протокол является первой попыткой прояснить механистическую связь между хориоамнионитом и более поздними возмущениями в развитии кишечника в качестве потенциальной связи между хориоамнионитом и NEC.

Introduction

Хорионные мембраны играют неотъемлемую роль в беременности млекопитающих. Они включают в себя хорион и амнион, которые служат нескольким функциям. Они окружают и защищают плод, облегчают сигнализацию паракрина между материнским и фетальнымотсеками 1и создают локальные петли обратной связи в хорионных мембранах, которые могут быть вовлечены в инициирование партуриции1. Текущее понимание мембран указывает на то, что амнион обеспечивает структурную барьерную функцию, а хорион обеспечивает иммунологический буфер в первую очередь для защиты развивающегося плода от материнской иммуннойсистемы 2. Воспаление этих мембран известно как хориоамнионит. Исторически, диагноз клинического хориоамнионит был сделан после наличия материнской лихорадки плюс один или несколько фетальных или материнскихклинических выводов 3,4. Однако, хотя это определение является клинически полезным, его отсутствие точности сделало исследования хориоамнионит сложной задачей. В 2015 году, в попытке прояснить диагноз, семинар экспертной группы Поник Кеннеди Шрайвер Национальный институт здоровья детей и развития человека определены chorioamnionitis как внутриматочное воспаление, или инфекции, или как (тройной I)3. Это разъяснение важно, потому что в то время как микробные индуцированной инфекции является важной причиной воспаления матки / амниотических, это происходит реже, чем стерильные матки / амниотическиевоспаления 5,6,7. В целом, хориоамнионит остается значительной проблемой общественного здравоохранения, как это видно в 2'u20124% от сроков родов и 25'u201230% преждевременныхродов 8,9.

Хориоамнионит может иметь значительное влияние на плод и новорожденных. Это было хорошо задокументировано в литературе, что хориоамнионит связан с повышенным риском многих заболеваний недоношенности, в том числе бронхолегочныхдисплазии 10, повреждение головногомозга белого вещества 11, внутрижелудочковоекровоизлияние 12, ретинопатиянедоношенности 13, и как подозреваемых и подтвержденных раннего начала неонатальногосепсиса 14,15. Поскольку мы заинтересованы в травмах и механизмах восстановления незрелого желудочно-кишечного тракта, важно отметить, что хориоамнионит также связан с более поздним развитием некротизирующего энтероколита (NEC)15,16. NEC является разрушительным желудочно-кишечным заболеванием недоношенных детей, что приводит к дисрегулируемой реакции хозяина на воспаление и последующий кишечныйнекроз 17. Каждый год, NEC затрагивает более 4000 младенцев в Соединенных Штатах, и до одной трети этих младенцев умирают от болезни18. Патогенез NEC, вероятно, включает в себя сочетание кишечной незрелости, дисрегуляции незрелой иммунной системы, воспаление кишечника, и бактериальнаятранслокация 19, кульминацией в окончательный общий путь кишечного некроза. Важно отметить, что начало NEC часто происходит через несколько недель после рождения и потенциального воздействия хориоамнионит, что делает механистическую связь между хориоамнионит и последующее развитие NEC неясно20. Один потенциальный механизм, с помощью которого хориоамнионит может способствовать патофизиологии NEC через upregulation материнской иммунной системы, впоследствии производя сильный воспалительный ответ плода, которые могут нарушить нормальные модели развития плода21,22,23.

Несколько млекопитающих модели хориоамнионит существуют угрызунов и овец 24,25,26,27,28,29,30,31,32. Тем не менее, существует мало данных, касающихся развития желудочно-кишечного тракта после первоначального периода новорожденных после хориоамнионит-индуцированного плода воздействия материнского воспаления (ФЕМИ). Для того, чтобы изучить взаимосвязь между FEMI и последующего развития травмы незрелого желудочно-кишечного тракта, мы адаптировали липополисахарид (LPS) индуцированной модели FEMI. Липополисахариды являются основным компонентом внеклеточной поверхности на грамотрицательных бактерий и являются мощным стимулятором врожденной иммунной системы нескольких эукариотических видов, в том числелюдей 33. Материнская инъекция LPS приводит к стерильному воспалительному каскаду без путевого воздействия живых бактерий, и это устоявшаяся модель индукции преждевременныхродов 34, а также модель острого хориоамнионита и фетального синдрома воспалительной реакции (FIRS), который является наиболее тяжелой формой хориоамнионит24,35. Было также показано, чтобы вызвать как церебральный белый и серый травмывещества в овец модель 36 и мурин модели37,38,39,40. Однако, насколько нам известно, мы первыми используем эту модель хориоамнионит и ФЕМИ для исследования его влияния на развитие желудочно-кишечного тракта при рождении, а также для изучения возможной механистической связи между хориоамнионитом и более поздним развитием NEC41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Айовы (Протокол #8041401). Все животные были размещены в Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AALAC), утвержденной виварием в Университете Айовы. Все мыши были дикого типа штамма C57Bl/6J.

1. Создание FEMI у беременных мышей

  1. Подготовка LPS
    1. Используйте LPS, полученные из Escherichia coli O55:B5 (концентрация запасов 2 мг/мл).
    2. Разбавить концентрацию запасов LPS 1:100 стерильным солевым раствором для рабочей концентрации 20 мкг/мл.
  2. Материнская инъекция LPS
    1. Инъекции беременных плотин в день беременности e15. Эта точка времени составляет примерно 75% через беременность мурина, что делает эту модель в развитии похож на начале третьего триместра беременности человека, который, когда большинство преждевременных родов из-за хориоамнионит происходят.
    2. Взвешивание беременных мышей непосредственно перед инъекцией, чтобы определить соответствующие LPS досирования.
    3. Рассчитайте дозу рабочей концентрации с помощью следующей формулы: 5 мкл х грамм массы тела (gbw), для общей дозы LPS 100 мкг/кг. Для контроля животных используйте эквивалентный объем нормального солевого раствора для инъекций.
    4. Vortex LPS решение три раза в течение 15 секунд на высоком до каждой инъекции.
    5. Нарисуйте объем LPS в шприц объемом 1 мл.
    6. Сдерживайте беременную мышь с помощью техники scruffing. Держите в спинной позиции лежа и выполнить инъекцию.
      1. Вставьте 30 калибровочных 8 мм иглы скошенной вверх по правому нижнему квадранту живота (чтобы избежать мочевого пузыря и брюшных сосудов) под углом 30 'u201240 ". Вставьте около 1/4 до 1/2 длины иглы.
      2. Потяните обратно на поршень шприца, чтобы обеспечить отрицательное давление до введения. Продолжить с инъекцией, если отрицательное давление присутствует.
      3. После инъекции, контролировать мышей в течение примерно 30 минут, а затем вернуться в клетки на оставшуюся часть беременности.

2. Доставка и уход за потомством, а также сбор урожая кишечника

  1. Доставка щенков, как правило, через вагинальные роды на e20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель имеет ожидаемый доза зависит плода потери, которые можно увидеть на рисунке 1 и обсуждается в результатах ниже.
  2. Разрешить щенков оставаться с матерями и получать ad libitum каналы.
  3. В день сбора урожая, обычно послеродовой день 14 (P14), усыпляют щенков через вывих шейки матки в соответствии с протоколами Комитета по уходу за животными и использованию.
  4. Используя ножницы и типсы, сделайте вертикальный разрез по средней линии живота, через кожу и брюшной полости, по всей длине живота. Акциз тонкой кишки из желудка в cecum с ножницами и удалить мезентерии с миппами.
  5. Изолировать и сохранить дистальный 1/3 тонкой кишки (раздел представитель человеческой илеи), отбрасывая проксимальной тонкой кишки, cecum, и толстой кишки.
  6. Разделите часть илеума пополам с помощью ножниц.
  7. Поместите проксимальную половину в раствор стабилизации РНК для более поздней количественной оценки РНК.
  8. Поместите дисттальную половину в 10% нейтральный буферный формалин для подготовки слайда.

3. Кишечные травмы забил

  1. Раздел парафин встроенных тканей в 5 мкм толщиной ломтиками и монтировать на стеклянных слайдах.

    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы отправляем образцы в гистологическое ядро для встраивания парафина, секции и монтажа на слайдах.
  2. Депараффинизируйте слайды в соответствии со стандартными процедурами.
  3. Пятна разделов с гематоксилином и эозином в соответствии со стандартными процедурами.
  4. Оценка разделов по 3-очковой шкале для кишечной травмы, как описаноранее 42,43.
    1. Используя световую микроскопию, оцените обобщенные повреждения кишечника двумя отдельными ослепленными следователями по 3-той шкале, оценивая целостность виллусов и отделениеот мембраны подвала 43 (Дополнительная цифра 1). Травмы кишечника лучше всего оценивать при 20-м увеличении и численной диафрагме 0,50.
    2. Назначьте оценку 0 для описания нормальной слизистой оболочки.
    3. Назначить оценку 1 описать легкую травму, которая включает в себя развитие пространства подпопителе гюнхагена, вакуолизации или подполепиальной подъема ограничивается ламина проприя или кончики вилли.
    4. Назначить оценку 2 для описания тяжелой травмы, указанной эпителиальной подъема и вакуолизации более половины вилли, villi искажения, или слизистой язвы и распада ламина проприии.

4. Количественная оценка клеток Панета и кубков

  1. После депараффинизации, пятно слайды тканей разделов от шага 2.8 с Alcian Blue / Периодические кислоты Шифф пятно для обозначения как кубок и Панет клеток, как описаноранее 44,45 в соответствии со следующими шагами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя Alcian Blue / Периодические кислоты Шифф пятно не является специфическим для Панет или кубок клетки, по нашему опыту, ослепленные опытные исследователи имеют эквивалент клеточной количественной оценки с использованием этого пятна по сравнению с клеточной целевых антител, со значительно меньшим фономокрашивания 46.
  2. Депараффинизировать, пятно, и обезвоживать слайды следующим образом.
    1. Погрузим горки в ксилен в течение 10 минут дважды.
      ВНИМАНИЕ: Ксилен следует использовать в дымовой капот.
    2. Промыть 100% EtOH.
    3. Погрузить слайды в 100% EtOH в течение 3 минут, затем в 90% EtOH в течение 3 минут, а затем 70% EtOH в течение 3 минут, и, наконец, погрузить слайды в 50% EtOH в течение 3 минут.
    4. Вымойте под проточной водопроводной водой в течение 5 минут.
      ВНИМАНИЕ: Навечьте секцию подальше от проточной воды, чтобы предотвратить потерю образца ткани.
    5. Фильтр Alcian синий пятно решение со стандартным фильтром кофе.
    6. Пятно слайды в Alcian синее пятно в течение 15 минут, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 2 мин.
    7. Разбавить 1 мг периодической кислоты в 200 мл двойной дистиллированной воды. Погрузим слайды в этот раствор на 5 мин. Затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 1 мин.
    8. Пятно с реагентом Шиффа в течение 10 минут. Вымойте под проточной водопроводной водой в течение 5 минут.
    9. Пятно слайды с гематоксилин в течение 1 мин, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 2 мин.
    10. Погрузить их в кислотный спирт (1 мл соляной кислоты, смешанной в 99 мл 70% EtOH) в течение 1 мин.
    11. Погрузитесь в водопроводную воду Скотта (0,1% концентрации NaHCO3 в водопроводной воде) в течение 1 мин, а затем мыть под проточной водопроводной водой в течение 1 мин.
    12. Обезвоживать слайды.
      1. Опустите каждый слайд 10 раз в 70% EtOH, затем окунитесь 10 раз в 90% EtOH, и 10 раз в 100% EtOH.
      2. Погрузим горки в 100% EtOH в течение 10 минут, а затем дважды погружаясь в свежий ксилен в течение 3 минут каждый.
    13. Поместите каплю монтажных средств массовой информации на образец и поместите на него крышку.
  3. Подсчет клеток Кубок
    1. Используя световую микроскопию, подсчитайте клетки кубков(дополнительный рисунок 2). Для каждой части кишечной ткани, подсчитайте количество клеток кубок и 500 эпителиальных клеток и выразить соотношение клеток кубок как соотношение на 100 эпителиальных клеток. Клетки кубков лучше всего рассчитывать на 20x увеличение и численное отверстие 0,5.
  4. Подсчет клеток Панет
    1. Используя световую микроскопию, подсчитайте клеткиПанета (дополнительный рисунок 2). Для каждого куска кишечной ткани, выразить как соотношение клеток Панет на кишечный склеп. Подсчитайте 100 кишечных склепов на каждый кусок кишечной ткани. Клетки Панета лучше всего учитывать при увеличении в 20х-60x и численной диафрагме 0,50-1,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Воздействие FEMI на эмбриональный день 15 приводит к дозозависимых потери беременности и доза зависит от скорости преждевременных родов (Рисунок 1)42. Для экспериментов, мы решили использовать дозу LPS 100 мкг/кг, чтобы свести к минимуму потерю беременности и недоношенность (50% потери между недоношенностью и внутриутробной гибели плода), подвергая плод значительное воспалительное оскорбление.

Используя этот подход, мы затем рассмотрели влияние FEMI на последующую травму потомства. Используя 3-точную гистологическую шкалу для измерения обобщенных кишечных травм, мы обнаружили значительные травмы при рождении (P0) и во взрослом возрасте (P56 или 8 недель жизни) (Рисунок 2). Важно отметить, что эта травма произошла при отсутствии каких-либо дополнительных стимулов для животных, кроме FEMI, предполагая, что FEMI только нарушает нормальный гомеостаз новорожденного мурина кишечного тракта. Как мышь рождается с относительно незрелым кишечника, который продолжает развиваться в течение первых 4 недельжизни 47,48, это имеет отношение к недоношенных детей, которые также имеют незрелые желудочно-кишечные тракты.

Чтобы лучше понять влияние ФЕМИ как на нормальное развитие кишечного эпителия, так и на защитные механизмы незрелого желудочно-кишечного тракта, мы количественно подсчитали количество муцин-производящих клетки кубок и противомикробные пептидно-производящие клетки Панета в дистальной трети малого кишечного тракта, который похож на человеческий илеум. Мы обнаружили, что FEMI нарушил нормальный состав кишечного эпителия, вызывая потерю как кубковых клеток, так и клеток Панета по сравнению с животными без FEMI(рисунок 3).

Для исследования влияния FEMI на неонатальную воспалительную реакцию, используя ELISA с электрохимилюминесценцией, мы количественно определить различные воспалительные маркеры сыворотки, которые включали IL-1, IL-10, KC-GRO (мурин эквивалент IL-8), и IL-6, из сыворотки щенков с и без FEMI (Рисунок 4). Мы обнаружили, что FEMI значительно увеличил воспалительный каскад для всех цитокинов на P0. Воспалительный каскад в более поздних возрастных группах (P7'u2012P56) отличался в зависимости от точки времени и цитокинов. Самое интересное, что для Ил-6 в FEMI и фиктивных группах были аналогичные уровни на уровне P7'u2012P28, но, несмотря на отсутствие вторичного вмешательства, в группе FEMI были значительно более высокие уровни в P56. Это особенно важно, поскольку мы продемонстрировали, что ИЛ-6 является критическим цитокином для развития послеродовой кишечной травмы в модели FEMI.

Figure 1
Рисунок 1: Влияние дозы FEMI на исходы беременности. Выживание пометов беременности зависит от дозы зависит с более высокими дозами вызывая более высокие показатели потерибеременности (A) и более высокие показатели преждевременных родов (B). Рисунок адаптирован с разрешения Fricke et al42. FEMI с использованием дозы LPS 100 мкг/кг создает 50% выживаемость для щенков на одну неделю жизни. Каждая точка данных является репрезентативной для n > 8 беременностей и по крайней мере трех индивидуальных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние FEMI на дистальные небольшие кишечные травмы моделей с течением времени. Образцы кишечника были собраны при рождении, 1 неделя жизни, 2 недели жизни, и 8 недель жизни от мышей, подвергшихся воздействию FEMI (100 мкг/кг LPS) или фиктивный контроль. Образцы были забиты с использованием 3-той точки травмы шкале ослепленныхследователей 42,43. FEMI только без дальнейших оскорблений индуцированных значительное количество травм при рождении, 1 неделя жизни, и на 8 недель жизни. Рисунок был адаптирован с разрешения Fricke et al.42. Каждая точка данных является репрезентативной для n > 10 щенков и по крайней мере трех индивидуальных экспериментов, по крайней мере, из 3 беременных плотин. Манн-Уитни не-параметрические T-тестирование было использовано для сравнения кишечных травм оценки на каждом времени. Звездочка указывает p < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: FEMI вызывает изменения нормального кубкового и Панетового количества клеток в тонком кишечнике во время развития. Образцы кишечника были собраны при рождении, 1, 2, 4 и 8 недель жизни у мышей, подвергшихся воздействию FEMI (100 мкг/кг LPS) или фиктивного контроля. Образцы были окрашены alcian синий / периодический кислоты Шифф пятно для обнаружения как кубок и Панет клетки, и они были количественно слепой следователь. И клетки кубок и клетки Paneth от животных с FEMI показали или тенденцию или значительно уменьшение сравненное к фиктивным управлениям на всех временах. Рисунок адаптирован с разрешения Elgin et al.41. Каждая точка данных является репрезентативной для n > 10 щенков и по крайней мере трех индивидуальных экспериментов. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего. Студенческое Т-тестирование использовалось для сравнения количества клеток кубок и Панет в каждой точке времени. Звездочка указывает p < 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: FEMI вызывает глобальный неонатальный воспалительный всплеск для всех цитокинов сразу после рождения в P0, с поздним всплеском IL-6 на P56. Цитокины сыворотки были количественно оценены на P0, P7, P14 и P28 с использованием ELISA с электрохимилюминесценцией в соответствии с инструкциями производителя, и пластины были прочитаны на 620 нм. Значения цитокина представлены здесь на радиолокационном участке, и все цитокины построены в процентах от максимальной стоимости. Значительно увеличились все цитокины (Ил-1, Ил-10, KC-GRO и IL-6) на P0 в группе FEMI по сравнению с контрольной группой (все р < 0,05). Существовал также возрождающийся увеличение уровня ИЛ-6 на P56 у щенков с FEMI по сравнению с не FEMI (р < 0,05 не-параметрических Крузкал-Уоллис тестирования), который был единственным цитокинов, который был значительно повышен в группе FEMI по сравнению с контролем в этот поздний момент времени. Рисунок адаптирован с разрешения Elgin et al.41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Кишечные травмы скоринга H'E окрашенных иловых тканей. Травмы оценки определяются по трех точкам кишечной травмы скоринга шкалы (0 'нормальный, 1 'мягкая травма, 2'тяжелая травма) на основе степени вилли vacuolization, слизистой язвы, ламина проприя повреждения, и наличие кровоизлияния в вилли, как описаноранее 43. Рисунок адаптирован с разрешения Elgin et al.41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная цифра 2: Представитель появление Alcian Blue / PAS окрашивания кубковых и Панет клеток. Alcian Blue/PAS окрашивание кишечных тканей позволяет четко визуализировать клетки кубков, присутствующие в кишечных вилли (верхняя панель отмечена белыми стрелками, изображение, взятое при увеличении в 20 раз), и клетки Панета, присутствующие в склепах Либеркуна, расположенные ниже кишечных вилли в ламина проприии (нижняя панель, отмеченная желтыми стрелками, изображение, взятое при увеличении в 60x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хориоамнионит влияет на 2'u20124% срока и 25'u201230% преждевременныхродов 8,9. Тем не менее, влияние хориоамнионит может продлить давнорождения,как было показано, оказывают значительное влияние на плоди новорожденных 10,11,12,13,14,15,16. Важно отметить, что хориоамнионит, как было показано, связан с последующим развитием NEC15,16. Хотя это еще не до конца понял, патогенез NEC, вероятно, включает в себя сочетание кишечной незрелости, дисрегуляции незрелой иммунной системы, воспаление кишечника, и бактериальной транслокации, кульминацией в окончательном общий путь кишечногонекроза 19. Тем не менее, механистическая связь между хориоамнионит и последующее развитие NEC остается неясным20, и предыдущие модели животных хориоамнионит были недостаточными для изучения этой взаимосвязи. Для устранения этого пробела в знаниях, мы изменили широко используемые LPS-индуцированной модели мурина хориоамнионити преждевременных родов 34,37,38,39,40, чтобы обеспечить неонатальные роды и выживание. При этом мы создали модель, которая приближается к воспалительному состоянию, замеченное вхориоамнионите 42, для изучения влияния воздействия воспаления плода на материнский (FEMI) на последующее развитие кишечника.

С помощью этого протокола, мы продемонстрировали, что эта модель мурина хориоамнионит, используя LPS-индуцированной FEMI, приводит как в краткосрочной и долгосрочной кишечной травмы, а также прерывание нормального развития кишечника, в первую очередь downregulation как кубок и Панет клетки, оба из которых обеспечивают первую линию врожденного иммунитета против воспаления кишечника. Повреждение кишечника и гистологические клеточные изменения, которые видны с этой моделью, указывает на то, что она является эффективной моделью для имитации травмы, замеченной в NEC. Это в первую очередь потому, что downregulation клеток Панет и кубковых клеток оба были вовлечены в патогенез NEC, и модели гистологических травм похожи на то, что видели в человеческих случаях NEC41,42,49. Таким образом, эта модель FEMI, вызванная LPS, является идеальной моделью для изучения механистической связи между хориоамнионитом и более поздними кишечными травмами, в частности развитием NEC, а также потенциальным воздействием хориоамнионита на развивающийся микробиом, который был бы не возможен с существующими моделями, использующими живые бактерии.

In vivo, chorioamnionitis часто включает в себя восходящую бактериальную инфекцию, которая часто приводит к преждевременному разрыву мембран и клинического фенотипа хориоамнионит, и животные модели хориоамнионит существуют, которые более точно отражают этупатофизиологию 25,28,30,32. Однако, поскольку наши лабораторные исследования развития кишечника, в том числе развивающихся микробиома, наличие живых бактерий в модели chorioamnionitis бы запутать микробиома анализа. Таким образом, существующие модели хориоамнионит с использованием живых бактерий непрактичны для изучения механистической связи между хориоамнионитом и более поздним развитием NEC. Кроме того, LPS-индуцированные модели хориоамнионит уже были эффективны в моделировании послеродовой белый и серыймозговой травмы вещества 36, демонстрируя, что этот метод является эффективным способом моделирования заболеваний недоношенных, которые связаны с воздействием хориоамнионит во время рождения.

Важно также отметить, что эта модель сильно зависит от дозы LPS, используемой для индуцирования FEMI. Основным важным шагом в этом протоколе является индукция FEMI в беременных плотин с внутриперитонеальной инъекцией LPS; поэтому неудивительно, что мы обнаружили, что доза LPS, используемая для индуцирования FEMI, чрезвычайно важна в результатах этих экспериментов. С первоначальными экспериментами, доза 100 мкг/кг LPS был использован, так как эта доза LPS не была связана с материнской смертностью и привело к примерно 50% неонатальной выживаемости, а также значительные травмы кишечника употомства 41,42.

LPS связывается с toll-like рецептором 4 (TLR4) комплекс, в результате чего агрегация внутриклеточных сигнальных белков, производство цитокинов, и начало провоспалительных сигнализации50. Платные рецепторы (TLRRs), включая TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9, имеют важное значение для индукции воспалительной реакции, которая наблюдается с различными патогенами и микроорганизмами, такими как вирусы, бактерии игрибки 51. Интересно, что upregulation TLR3 также было показано, коррелируют с увеличением гистологических повреждений кишечника и вирусных пролить в неонатальной модели ротавируса мурина; кроме того, нокаут TLR3 улучшены эти эффекты52. Таким образом, хотя модель использует пути TLR4, разумно предположить, что стимуляция других TLRs может предоставить аналогичные выводы.

Используя эту методологию, мы смогли показать, что инъекция LPS в беременных плотин вызывает увеличение материнских, плацентаных и воспалительных маркеров плода, щадя амниотической жидкости, а также вызывая прямое повреждение плаценты42. Интересно, что эта методология не показала изменения резистентности в артериях матки. Модель FEMI также оказывает значительное влияние на потомство, как мы показали, что открытые щенки имеют значительные повреждениякишечника 42 через IL-6 зависимогопути 41 и может повлиять на важные защитные механизмы кишечника, такие как клетки кубок и клетки Панет41. Эта травма делает неонатального потомства все более восприимчивыми к последующим LPS-индуцированной кишечной травмыи воспаления 41, которые могут объяснить, почему младенцы подвергаются хориоамнионит имеют повышенную восприимчивость к развитию NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (DK097335 и T32AI007260) и Семейным отделением педиатрии Университета Айовы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
  2. Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
  3. Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
  4. Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
  5. Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
  6. Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
  7. Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
  8. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  9. Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
  10. Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
  11. Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
  12. Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
  13. Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
  14. Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
  15. Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
  16. Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
  17. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
  18. Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
  19. Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
  20. Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
  21. Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
  22. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  23. Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
  24. Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
  25. Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
  26. Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
  27. Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
  28. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  29. Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
  30. Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
  31. Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
  32. Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
  33. Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
  34. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
  35. Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
  36. Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
  37. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  38. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
  39. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
  40. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  41. Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  42. Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
  43. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
  44. Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
  45. McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
  46. McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
  47. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
  48. McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
  49. McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
  50. Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
  51. Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
  52. Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 160 Lipopolysaccharide (LPS) Фетальное воздействие материнского воспаления (FEMI) Chorioamnionitis развитие кишечника Панет клетки гоблет клетки
Мурин модель плода воздействия материнского воспаления для изучения последствий острого хориоамнионит на развитие кишечника новорожденных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke,… More

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke, E. M., Gong, H., Reese, J., McElroy, S. J. A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development. J. Vis. Exp. (160), e61464, doi:10.3791/61464 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter