शारीरिक ल्युकोसैट ई selectin की मध्यस्थता रोलिंग की Microvascular endothelium पर विश्लेषण

Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009, doi:10.3791/1009 (2009).

1. फ्लो चैंबर के लिए hBMEC (सेल HBMEC 60) की तैयारी पेट्री डिश पर monolayer

1. 35 कोट x 37 में 10mm ऊतक संस्कृति 20μg/ml fibronectin की 2ml 4 में रातोंरात ° सी (पीबीएस में) के साथ या 3 घंटे के लिए बर्तन ° सी.
2. व्यंजनों से fibronectin समाधान Aspirate और 1.5 x10 ⁵ HBMEC 60 कोशिकाओं को जोड़ने के [199 मध्यम HEPES और Glutamine, के साथ 10% FBS, 10% मानव सीरम, 5 इकाइयों / एमएल हेपरिन, 1ng/ml पुनः संयोजक मानव fibroblast वृद्धि कारक, 1 % पेनिसिलीन ] स्ट्रेप्टोमाइसिन पकवान और उन्हें> 90% संगम को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं. (यह 2 दिन लगते हैं)
3. विकास मीडिया Aspirate और ई selectin की अभिव्यक्ति विनियमित, आईएल 1β 50ng/mL के साथ 4-6 घंटे के लिए ताजा मध्यम जोड़ने. सेल monolayers अब परख रोलिंग करने के लिए तैयार हैं. ई selectin समारोह ब्लॉक, मानव विरोधी ई selectin मोआब सी. (क्लोन (5D11) BBIG-E4) ~ 1hr 20μg/ml में 37 में जोड़ा जा सकता ° निष्क्रिय

2. फ्लो चैंबर के लिए मानव hematopoietic पूर्वपुस्र्ष KG1a कक्ष की तैयारी

1. मानव hematopoietic पूर्वपुस्र्ष KG1a कोशिकाओं confluency बड़े हो रहे हैं (1x10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल) glutamine के साथ RPMI - 1640 में और 10% FBS / 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और प्रवाह चैम्बर परख में उपयोग के लिए कुप्पी से सीधे pipetted.
2. सेल नंबर एक hemacytometer और तो कोशिकाओं रहे हैं 1 एक्स 10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल 10mm (एच / एच बफर) HEPES और 2mm CaCl ₂ के साथ HBSS में फिर से निलंबित का उपयोग कर की गणना है
3. कक्ष परख में उपयोग करें जब तक बर्फ पर संग्रहीत हैं.

3. माइक्रोस्कोप, समानांतर - प्लेट फ्लो चैंबर और सिरिंज पम्प (चित्रा 1) की तैयारी

चित्रा 1 समानांतर प्लेट फ्लो चैंबर विश्लेषण का चित्रण. उल्टे माइक्रोस्कोप, हार्वर्ड सिरिंज पम्प, कंप्यूटर कैमरा / और समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल विश्लेषण के लिए एक इष्टतम व्यवस्था में रखा जाता है.

1. शक्ति और प्रकाश स्रोत पर उलटा माइक्रोस्कोप और सिरिंज पम्प करने की शक्ति के लिए मुड़ें और खुर्दबीन पर 10X उद्देश्य का चयन करें.
2. धारक में 50ml शंक्वाकार ट्यूब प्लेस और / एच एच और 2mm ₂ CaCl के साथ भरें .
3. परीक्षण 50ml शंक्वाकार ट्यूब नीचे ट्यूब धारक प्लेस में 5ml प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब
4. सिरिंज पम्प में 60ml सिरिंज प्लेस () सुनिश्चित करें कि सवार दोनों और सिरिंज के शरीर दोनों सुरक्षित हैं.
5. 3 - रास्ता बंद मुर्गा संलग्न 60ml सिरिंज के अंत और 3 - रास्ता बंद मुर्गा 5ml सिरिंज देते हैं.
6. प्लेस समानांतर प्रवाह खुर्दबीन मंच पर चैंबर (GlycoTech इंक) इनपुट सही करने के लिए ट्यूब, उत्पादन में छोड़ दिया और वापस करने के लिए वैक्यूम ट्यूब ट्यूब के साथ उपकरण.
7. निर्वात और खुली हवा वाल्व वैक्यूम टयूबिंग संलग्न करने के लिए समानांतर थाली तंत्र चरण का पालन करने के लिए अनुमति देते हैं. (यह परीक्षण अगर प्रवाह कक्ष पर वैक्यूम स्कर्ट हवा तंग है.) बंद हवा वाल्व बंद.
8. उत्पादन टयूबिंग (माइक्रोस्कोप के बाईं तरफ) लाइन के लिए तीन तरह से बंद मुर्गा संलग्न. उपकरण अब HBMEC-60 monolayer प्लेट पर रखने के लिए तैयार है.
9. प्लेस HBMEC-60 monolayer और माइक्रोस्कोप के केंद्र पर थाली जगह.
10. निर्वात और स्थिति ऐसी है कि monolayer थाली केंद्र में थाली के ऊपर प्रवाह चैम्बर तंत्र पर मुड़ें.
11. धीरे HBMEC-60 monolayer थाली पर कम प्रवाह चैम्बर तंत्र और प्रवाह चैम्बर तंत्र चूषण के लिए नीचे की अनुमति. (वहाँ हवा से बचने का कोई लग रहा है हो सकता है और इस बिंदु पर आप कक्ष के लिए दबाव लागू करने के लिए रबर गैसकेट सेक की आवश्यकता हो सकती है चाहिए.)
12. एक बार वैक्यूम स्थापित किया गया है, जगह इनपुट ट्यूब 50ml शंक्वाकार 2mm CaCl के _साथ 2 / एच एच युक्त ट्यूब में (सही पर) .
13. ओपन 3 तरह के 60ml सिरिंज और में जगह पंप में प्रवाह की अनुमति बंद मुर्गा पंप मोड. "
14. थाली पर कोशिकाओं को उठाने के बिना इनपुट / आउटपुट लाइनों से हवा निकालने के लिए, सिरिंज 2mL/minute पर सेट सेवन ट्यूब को भरने के पम्प का उपयोग करते हैं, तो जल्दी से 0.5 से सेट बस / एमएल मिनट पहले तरल पदार्थ तंत्र तक पहुँचता है. यह जरूरी है इस ध्यान से सेट और हवाई बुलबुले जो थाली से monolayer उठा लूँगा से बचने के लिए प्रधानमंत्री है.
15. एक बार तरल पदार्थ 60ml सिरिंज, प्रवाह चैम्बर और सिरिंज पम्प में स्थानांतरित करने के लिए देखा जाता है primed किया गया है और प्रवाह चैम्बर उपयोग के लिए तैयार है. इस सेट अप प्रत्येक कक्ष इनपुट चलाने के लिए और प्रत्येक नई प्लेट की जरूरत के लिए दोहराया जाएगा.

4. ल्युकोसैट रोलिंग एनआईएस तत्वों का उपयोग घटनाक्रम पर कब्जा

1. ओपन डेस्कटॉप पर एनआईएस तत्वों.
2. प्रेस "खेल" जीना छवि के लिए चिह्न. ऑटो एक्स्पोज़र आप थाली अब के लिए आसान देखने के लिए अनुमति देते हैं और ध्यान केंद्रित के लिए महत्वपूर्ण है.
3. यकीन है कि खुर्दबीन ठीक सेल monolayer पर ध्यान केंद्रित है.
4. एक बार ध्यान केंद्रित है, तो फिर सेट एक खुर्दबीन पर फ्रेम / दूसरा और समायोजित प्रकाश के लिए जोखिम. छवि कंप्यूटर पर दिखाई और अब खुर्दबीन कम प्रकाश के स्तर को कारण दृश्यदर्शी में दिखाई जानी चाहिए. लाइट हिस्टोग्राम तो विज्ञापन किया जा सकता हैjusted पृष्ठभूमि जोखिम को हटाने या सेल स्पष्टता में सुधार.
5. 2X2 बिन या लाइव बिन पर क्लिक करें तस्वीर है कि फिल्म पर कब्जा करने के लिए आदर्श है प्राप्त करने के लिए
6. मेनू पट्टी पर "मैक्रो" पर क्लिक करें और चुनें "बंदरगाह करने के लिए लिखने के", का चयन करें बंदरगाह "com3," और "खुला". (यह सिरिंज पम्प के साथ समन्वय स्थापित करने के लिए बंदरगाह खोलता है.
7. इनपुट टयूबिंग लाइन के पास 5ml टेस्ट ट्यूब में KG1a सेल निलंबन के पिपेट 1ml और तब टेस्ट ट्यूब के नीचे करने के लिए इनपुट टयूबिंग लाइन जगह है.
8. मेनू पट्टी के पास जाओ, "कैद" पर क्लिक करें, "अधिग्रहण के समय चूक."
9. एक नया मेनू को पॉप जाएगा. प्रोटोकॉल स्थायी 210 सेकंड का चयन करें, इस HBMEC 60 कक्ष पर रोलिंग के लिए कार्यक्रम की लंबाई है. (प्रत्येक चरण के लिए एक तस्वीर पंप प्रोटोकॉल की अवधि के लिए हर दूसरा ले क्रमादेशित है यह भी com3 करने के लिए पंप शुरू बंदरगाह के माध्यम से एक आदेश भेजने के लिए सेट कर दिया जाता है.) यदि समय चूक बाधित है, पंप बंद नहीं होगा अपने दम पर और रीसेट किया जाना चाहिए. छवि जीने पर लौटने के लिए रद्द करें दबाएँ.
10. "कार्यक्रम के मोड" के अनुसार अनुदेश मैनुअल सिरिंज पम्प सेट. (कार्यक्रम मोड विशिष्ट प्रवाह दर (यानी कतरनी तनाव का स्तर) कक्ष के भीतर दी जाएगी और HBMEC-60 सेल monolayer पर KG1a सेल बातचीत हुक्म के मैनुअल प्रोग्रामिंग के लिए अनुमति देता है.) KG1a सेल hBMEC कक्ष पर रोलिंग के लिए सेटिंग्स के रूप में 4.2 dynes 45 एस / ² सेमी, 0.3 dynes / 60 एस ² सेमी, और stepwise बढ़ जाती है हर 15 dynes 4.2 / ² सेमी की एक अधिकतम करने के लिए
11. दीवार कक्ष में कतरनी तनाव (डब्ल्यू _{सेंट)} निम्नलिखित समीकरण के अनुसार गणना की गई: डब्ल्यू _सेंट = 6μQ / ² ख, जहां μ मीडिया (०.००७६ पी) की अनुमानित चिपचिपापन है, क्यू मिलीलीटर में बड़ा प्रवाह दर / है, एक सेमी में चैनल (पाल बांधने की रस्सी मोटाई) ऊंचाई (0.03 सेमी) है, और ख सेमी (0.5 सेमी) में चैनल चौड़ाई है. प्रवाह दरों सिरिंज पम्प के कार्यक्रम मोड का उपयोग करते हुए विनियमित रहे थे.
12. माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर अब समय चूक फोटोग्राफी पर कब्जा करने के लिए तैयार हैं. प्रेस "शुरू चलाने" डेटा प्राप्त शुरू करने के लिए कंप्यूटर पर. जबकि कार्यक्रम चल रहे हैं, परीक्षण KG1a कोशिकाओं से युक्त ट्यूब के लिए मीडिया को जोड़ने (यकीन है कि वहाँ कोई हवाई बुलबुले हैं) के क्रम में इनपुट / आउटपुट टयूबिंग के माध्यम से भरा रखने के लिए सुनिश्चित हो.

5. टर्मिनल Sialylation और ई selectin की मध्यस्थता KG1a 5 सेल के लिए भूतल glycoprotein की निर्भरता. रॉलिंग (चित्रा 2, 5.1-5.5 के वीडियो क्लिप्स)

1. KG1a पर रोलिंग सेल की परख गैर उत्तेजित HBMEC 60 कोशिकाओं (नकारात्मक नियंत्रण) KG1a कोशिकाओं को तैयार थे और प्रवाह पर चैम्बर में संचार रहते गैर आईएल 1β उत्तेजित HBMEC 60 के रूप में ऊपर वर्णित है.
2. KG1a सेल की परख HBMEC 60 आईएल 1β के साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं पर रोलिंग (ई selectin निर्भरता नियंत्रण). KG1a कोशिकाओं को तैयार थे और प्रवाह पर चैम्बर में संचार रहते आईएल 1β उत्तेजित HBMEC 60 के रूप में ऊपर वर्णित है.
3. KG1a सेल की परख HBMEC 60-कोशिकाओं पर रोलिंग पूर्व आईएल 1β और तब निष्क्रिय विरोधी मानव ई selectin मोआब. (ई selectin निर्भरता नियंत्रण) KG1a कोशिकाओं तैयार थे और प्रवाह चैम्बर में रहते हैं पर संचार आईएल के साथ इलाज 1β उत्तेजित HBMEC निष्क्रिय विरोधी मानव ई selectin मोआब के रूप में ऊपर वर्णित के साथ 60 pretreated.
4. आईएल 1β उत्तेजित HBMEC-60 sialidase - पचा KG1a रोलिंग सेल की परख. KG1a 37 पर 0.1U/ml विब्रियो 1hr लिए neuraminidase कोलरा ° सी के साथ pretreated कोशिकाओं को तैयार थे और प्रवाह पर चैम्बर में संचार रहते आईएल 1β उत्तेजित HBMEC 60 के रूप में ऊपर वर्णित है.
5. आईएल 1β उत्तेजित HBMEC-60 protease-पचा KG1a रोलिंग सेल की परख. KG1a protease साथ pretreated कोशिकाओं, 1hr के लिए 37 0.2U/ml Bromelain ° सी, तैयार थे और प्रवाह पर चेंबर में संचार आईएल रहते 1β उत्तेजित HBMEC 60 के रूप में ऊपर वर्णित है.

6. एनआईएस - तत्वों पकड़े KG1a कोशिकाओं और KG1a सेल के रेखांकन रोलिंग डेटा का विश्लेषण

1. समय अनुक्रम के बाद हासिल कर ली है, डेटा को बचाने के.
2. मेनू पट्टी पर "उपाय" टैब पर जाएँ और चुनें "दहलीज को परिभाषित." सलाखों हटो वांछित कोशिकाओं इतना है कि लाल रंग में रंग रहे हैं. चुनें "सभी छवियों" तो "ठीक है". पूरे समय चूक अनुक्रम अब दिखाई लाल रोलिंग कोशिकाओं के साथ संशोधित किया जाना चाहिए.
3. "उपाय" का चयन करें और जाओ "प्रतिबंध." (प्रतिबंध उपयोगकर्ता thresholded वस्तुओं है कि रोलिंग कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं करते बाहर करने की अनुमति यह मुख्य रूप से पृष्ठभूमि HBMEC-60 monolayer द्वारा बनाई गई है.) "क्षेत्र" और इनपुट और रोलिंग कोशिकाओं के लिए क्षेत्र के लिए न्यूनतम और अधिकतम मानों का चयन करें. "बढ़ाव" और के लिए इस चरण को दोहराएँ "घेरा है."
4. "उपाय" का चयन करें और चुनें "बाइनरी प्रतिबंध का उपयोग कर बनाने के लिए", और प्रतिबंध मूल्यों को निर्धारित करने के लिए HBMEC 60-कोशिकाओं के monolayer पर एनआईएस - तत्वों रोलिंग कोशिकाओं के सॉफ्टवेयर मान्यता का अनुकूलन.
5. वापस जाओ "उपाय", "फ़ील्ड डेटा का चयन करें, और फिर" रीसेट डेटा का चयन करें. यह मेनू बंद है.
6. "उपाय" और से करने के लिए लौटें"स्कैन क्षेत्र" lect.
7. खोलें "उपाय", "फील्ड डेटा" संख्या या ऑब्जेक्ट्स "का चयन करें और फिर" सभी क्षेत्रों "का चयन करें और Microsoft Excel में डेटा निर्यात.
8. "स्पष्ट डेटा" अगले डेटा संग्रह के लिए एनआईएस - तत्वों सेल अधिग्रहण तैयार चुनें.

परिणाम:

चित्रा 3 KG1a कक्ष पर ई selectin - बाध्यकारी गतिविधि के प्रवाह समानांतर प्लेट चैंबर विश्लेषण. KG1a sialidase या protease के साथ इलाज किया कोशिकाओं HBMEC 60 आईएल 1β के साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं के monolayers पर दक्षता रोलिंग के लिए विश्लेषण किया गया. नकारात्मक प्रयोगों रोलिंग नियंत्रण भी KG1a गैर आईएल 1β उत्तेजित HBMEC -60 कोशिकाओं पर या पर रोलिंग सेल का विश्लेषण द्वारा आयोजित की गई आईएल 1β उत्तेजित HBMEC 60 विरोधी मानव ई selectin मोआब (5D11) को निष्क्रिय करने के साथ इलाज किया कोशिकाओं. सेल रोलिंग आवृत्तियों तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया गया और एनआईएस - तत्वों सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण. (* सांख्यिकीय महत्व है, पी <0.001)

शारीरिक कतरनी तनाव की शर्तों के तहत endothelial सेल बातचीत - वीडियो आधारित इस रिपोर्ट में, हम कैसे का विश्लेषण करने के लिए ल्युकोसैट के एक दृश्य चित्रण प्रदान की. ल्युकोसैट tethering mediating और रोलिंग, एक चिपकने वाला integrins और hyaluronan रिसेप्टर्स के रूप में रिसेप्टर्स के माध्यम से माध्यमिक और अधिक स्थिर बंधन गतिविधियों की प्रतिबद्धता के लिए आवश्यक व्यवहार में ई selectin ligands - विशेष रूप में, हम ई selectin की भूमिका का विश्लेषण किया. समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर एक औंधा माइक्रोस्कोप, हार्वर्ड सिरिंज पम्प, वीडियो कैमरा और कंप्यूटर / सेल अधिग्रहण हार्डवेयर के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित का उपयोग, हम किए गए प्रयोगों ई selectin ligand जिसमें + KG1a कोशिकाओं हमारे ल्युकोसैट मॉडल और hBMEC कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया (HBMEC 60) समर्थक भड़काऊ cytokine, आईएल 1β के साथ प्रेरित, हमारे ई - selectin + मानव endothelial सेल मॉडल (06/01) के रूप में इस्तेमाल किया गया. जैसा कि पहले बताया, हम पर मजबूत KG1a रोलिंग सेल मनाया आईएल 1β उत्तेजित HBMEC 60 कतरनी तनाव के स्तर की एक ई selectin निर्भर तरीके (चित्रा 3) (सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर है जब KG1a सेल पर रोलिंग के साथ तुलना में एक सीमा से अधिक कोशिकाओं गैर आईएल 1β उत्तेजित - HBMEC 60 कोशिकाओं). नकारात्मक नियंत्रण, जो KG1a गैर आईएल 1β उत्तेजित HBMEC-60 कोशिकाओं या सेल रोलिंग शामिल आईएल 1β - प्रेरित विरोधी मानव ई selectin MAB साथ HBEMC 60 कोशिकाओं pretreated, समानांतर में प्रदर्शन किया गया करने के लिए निर्भरता का प्रदर्शन साइटोकाइन उत्तेजना और रोलिंग गतिविधि के लिए ई - selectin अभिव्यक्ति (चित्रा 3). इसके अलावा, KG1a विब्रियो कोलरा के साथ pretreated कोशिकाओं के रोलिंग विश्लेषण neuraminidase (sialidase) या bromelain, एक गैर विशिष्ट protease सतह ई selectin ग्लाइकोप्रोटीन ligand पचाने के लिए जाना जाता है, के साथ ई - selectin ligand के लिए टर्मिनल सियालिक एसिड के अवशेष और सतह ग्लाइकोप्रोटीन के महत्व पर प्रकाश डाला गतिविधि (2,3).

समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर विश्लेषण इन विट्रो परख प्रणाली में एक विशेष ल्युकोसैट अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया है - कतरनी तनाव समान शर्तों के तहत endothelial चिपकने वाला बातचीत के बाद केशिका venule की सतह पर दिया. ल्युकोसैट tethering mediating और सक्रिय microvascular endothelium की सतह पर रोलिंग में ई selectin ligands - जैसा कि हमारे दृश्य प्रस्तुति में यहाँ दर्शाया गया है, हम ई selectin की भूमिका की जांच के लिए इस प्रणाली का मूल्य प्रदर्शित. हम यह भी protease glycosidase, और इस प्रणाली में ई selectin और अपने ligands की भूमिका elucidating के लिए अवरुद्ध एंटीबॉडी उपचार के आवेदन प्रकट करते हैं. ये विश्लेषण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और ई selectin के अध्ययन के लिए एक प्रायोगिक आधार के रूप में मदद - ई - selectin vivo में ligand समारोह.

साइटोकाइन सक्रिय microvascular endothelial कोशिकाओं (hBMEC या मानव नाल की शिरा या त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं) के monolayers साथ कोशिका आसंजन का अध्ययन करने के अलावा, assays पुनः संयोजक मानव ई selectin या एक सब्सट्रेट के रूप में ई selectin पुलिस महानिरीक्षक chimeric अणुओं शुद्ध का उपयोग किया जा सकता है है कोशिका आसंजन के लिए. अन्य चिपकने वाला बातचीत ल्युकोसैट (एल) selectin और प्लेटलेट (पी) selectin भी समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर प्रौद्योगिकी का उपयोग कर assayed किया जा सकता है के माध्यम से मध्यस्थता. सेल सब्सट्रेट / monolayer प्रोटीन के प्रकार से अलग है या इनपुट ल्युकोसैट / selectin transfectant सेल मॉडल की, जांचकर्ताओं को शारीरिक कतरनी तनाव की शर्तों के तहत इन मुलाकातों की भूमिका का अध्ययन कर सकते हैं.

लेखकों ब्याज या खुलासे की कोई संघर्ष है.

एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर अवार्ड (चार्ल्स जे Dimitroff 06-024-01-CSM) द्वारा इस परियोजना के लिए अनुदान प्रदान किया गया, स्वास्थ्य / राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान (RO1CA118124 चार्ल्स जे Dimitroff) के राष्ट्रीय संस्थानों, और स्वास्थ्य / राष्ट्रीय गठिया और Musculoskeletal संस्थान और त्वचा रोग अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (p30 डॉ. थॉमस एस Kupper AR042689, ब्रिघम और महिला अस्पताल, बोस्टन, MA).

1. Dimitroff CJ, Kupper TS, Sackstein R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018,(2003).
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