主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).

收获从股骨和胫骨骨髓

1. 该过程的第一步是，收获从6股骨和胫骨骨髓 - 12周龄小鼠（我们使用的是BALB / c小鼠，但你可以用此过程中，任何小鼠品系）。首先，安乐死的CO ₂吸入（将不会被显示）鼠标。收获从每个后腿股骨和胫骨。然后，用刀片，切删除的髋关节和膝关节股骨的两端，暴露骨髓。
2. 以类似的方式，削减的胫骨的两端删除膝，踝关节的邻近地区，并揭露了骨髓。
3. 以26号针头与3毫升注射器和填充用RPMI 10％胎牛血清，青霉素，链霉素，和β-巯基乙醇（BME = 100 UM）的补充。使用镊子，缓缴的Petri菜的RPMI媒体骨。骨的一端插入注射器针头，压低柱塞冲洗出骨髓。注射器针头，可以向上和向下移动，骨内，以冲洗掉残留骨髓。
4. 重复的过程中，所有的骨头，然后着手建立的文化。

建立文化

1. 要建立的骨髓文化，吸刷新骨髓几次分手组织成细胞悬液。
2. 50 mL锥形管上放置一个70微米的过滤器，过滤器，并添加细胞悬液。
3. 冲洗培养皿中，用RPMI一次，然后添加到70微米的过滤器冲洗。
4. 使用1 mL注射器柱塞橡胶年底，磨70微米的过滤器上的剩余的骨髓片。
5. 用RPMI清洗一次过滤器。
6. 清洗过滤器后，在5分钟1200转离心细胞悬液。
7. resuspending在PBS清洗细胞沉淀。
8. 使用血球计数细胞。我们通常会获得从一只老鼠的骨骼（两股骨加两个胫骨）〜90亿个细胞。细胞计数后，他们再次在5分钟1200转离心。
9. 重悬在少量的RPMI和分装到含有足够的RPMI使终浓度为每毫升1万细胞的组织培养瓶中细胞。
10. 添加细胞因子，促进发展您感兴趣的细胞类型。在这种情况下，添加细胞因子白细胞介素3（IL - 3 = 10毫微克/毫升）嗜碱性粒细胞和肥大细胞，促进发展。为了获得嗜碱性粒细胞，孵育10天。对于肥大细胞，培育5个星期。当生成肥大细胞，媒体和IL - 3，应每周更换一次。
11. 这里是在肥大细胞应如何电镀后出现。这个图像演示肥大骨髓细胞嗜碱性粒细胞和肥大细胞后10天白细胞介素- 3除了的分化。
12. 一旦获得所需的细胞类型，进行电一步。

电穿孔细胞

1. 要开始的电击一步，决定在培养瓶中的细胞数量。
2. 细胞通常在电穿孔密度每毫升10万，转移所需的细胞数量，锥形管，并在5分钟1200转离心管。
3. 离心后，吸媒体，用1X PBS清洗细胞，并再次离心5分钟1200转。
4. 吸出PBS和添加Bio - Rad公司的基因脉冲电缓冲区，使细胞每毫升10万的细胞悬液。
5. resuspending的细胞后，加入终浓度在10至20微克每毫升所需的质粒DNA。
6. 分装150微升到您所选择的井的细胞悬液，在96孔的电板。
7. MXcell板室的电板，并盖上盖子。
8. 肥大细胞的转染之前，必须编程电协议进入的MXcell，除非使用预设或存储协议。通过优化实验，我们发现，肥大细胞的转染效率最高发生使用方波脉冲协议。我们将根据板的电条件，提供300V/20ms，350/15ms，350V/20ms和350V/10ms方波脉冲，在2000uF和1000欧姆。一旦协议已经设置并加载到设备上，按“脉冲”electroporate细胞。
9. 电完成后，转移到组织培养板的细胞。我们通常将每个150微升电样品以及一个48孔组织培养板与白细胞介素- 3每毫升10毫微克含300微升的RPMI（含10％FCS，青霉素，链霉素，和β-巯基乙醇补充）。细胞孵育过夜在37 ° C，然后在24小时后测定表达和抑制。

陈德良sfection结果

成功后，使用质粒GFP的每毫升20微克的电的细胞的荧光显微镜图像显示视频。可使用MXcell电系统的大约30％的转染效率。该系统使您可以改变条件，最大限度地提高您转染效率，同时保持细胞活力。

随着越来越多的基因组信息的出现，并开发新的工具，如siRNA的，使用的有关生理细胞已变得越来越重要，我们进一步了解疾病的途径，蛋白 - 蛋白相互作用和信号转导。主要细胞是直接从组织或体液，并在体外培养。方式，包括通过引入外源遗传物质，这些细胞可以被操纵。这是越来越明显，引入的原代细胞的质粒DNA或siRNA的最有效的方法是电击。

电穿孔公开细胞电脉冲，以瞬时提高细胞膜的通透性，从而使外源核酸进入细胞。这种转染的方法，可以优化，以适应不同类型的细胞/线，因此，可用于转染肥大细胞，以及任何其他骨髓衍生的细胞之间的差异。此外，与病毒介导的转染，电不转染DNA的大小施加限制，也不需要大量的准备。相比之下脂质介导的转染，电可以毒性较低，不会导致转染的核酸内体诱捕。

Bio - Rad公司已经开发出了MXcell电系统，专门为这些细胞。 MXcell允许您以不同条件，最大限度地提高您转染效率和细胞活力。为了优化转染效率和减少细胞死亡，众多的电参数，包括电压，电容，电阻，脉冲长度可以调整和评估。

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.