エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).

大腿骨と脛骨から骨髄を採取

1. 12週齢のマウス（我々はBALB / cマウスを使用しているが、任意のマウス系統では、この手順を行うことができます）に - 手順の最初のステップは、6の大腿骨と脛骨から骨髄を採取することです。開始するには、CO ₂吸入（表示されません）でマウスを安楽死させる。それぞれの後ろ足から収穫の大腿骨と脛骨。その後、カミソリの刃で、股関節と膝関節を削除するには、大腿骨の両端をカットして骨髄を公開する。
2. 同様の方法では、膝と足首の隣接領域を削除すると骨髄を公開するために脛骨のそれぞれの端をカット。
3. 26ゲージの針3 mLシリンジを取り、10％FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびβ-メル​​カプトエタノール（BME = 100 UM）を添加したRPMIで塗りつぶす。ピンセットを使用して、RPMI培地を含むペトリ皿上の骨を保持する。骨の一端に注射針を挿入し、骨髄をフラッシュするためにプランジャーを押し下げる。注射針が残留骨髄を吐き出すのに骨の内部で上下に移動することができます。
4. 文化の確立を続行してすべてのボーンのための手順を繰り返し、と。

文化の確立

1. 骨髄培養を確立するために、細胞懸濁液中に組織を分割するには、上下に数回フラッシュされた骨髄をピペット。
2. 50 mLコニカルチューブの上に70ミクロンのフィルターを配置し、フィルターに細胞懸濁液を加える。
3. RPMIでペトリ皿を一度洗い流した後、70ミクロンのフィルターにすすぎ追加。
4. 1 mLのシリンジプランジャのゴムのエンドを使用して、70ミクロンのフィルターの上に残っている骨髄の部分を挽く。
5. RPMIでフィルタを1回洗浄する。
6. フィルターを洗浄した後、5分間1200rpmで細胞懸濁液を遠心してください。
7. PBSに再懸濁することにより細胞ペレットを洗浄します。
8. 血球計算板を用いて細胞を数える。我々は通常、1つのマウスの骨（二大腿骨と2つの脛骨）から〜90万個の細胞を得る。細胞をカウントした後、5分間1200rpmで再度遠心する。
9. RPMIと注し、その最終的な濃度がmLの当たり1万個の細胞であることを十分にRPMIを含む組織培養フラスコに少量の細胞を再懸濁します。
10. 興味のある細胞のタイプの開発を促進するサイトカインを追加。このケースでは、サイトカインのインターロイキン-3（IL - 3 =は10 ng / mL）を好塩​​基球およびマスト細胞の発達を促進するために追加されます。好塩基球を取得するには、10日間インキュベートする。肥満細胞の場合は、5週間インキュベートする。肥満細胞を生成するときに、メディアおよびIL - 3は、週に1回交換する必要があります。
11. ここだけのメッキの後に表示される方法肥満細胞を見ている。この画像は、10日間のインターロイキン- 3を添加した後、好塩基球とマスト細胞にマスト骨髄細胞の分化を示しています。
12. 所望の細胞タイプを取得すると、エレクトロポレーションのステップに進みます。

Electroporatingセル

1. エレクトロポレーションのステップを開始するには、培養フラスコ中の細胞の数を決定します。
2. 細胞は通常はmLの1千万人もの密度でエレクトロポレーションされているので、必要な細胞数は、コニカルチューブに移して5分間1200rpmでチューブを遠心する。
3. 遠心分離した後、1 × PBSで細胞を洗浄し、5分間1200rpmで再び遠心、培地を吸引除去する。
4. PBSを吸引除去し、mL当たり107細胞の細胞懸濁液を作るためにバイオラッドジーンパルサーのエレクトロポレーションバッファーを追加します。
5. 細胞を再懸濁させた後、液あたり10〜20マイクログラムの最終濃度で所望のプラスミドDNAを加える。
6. 96ウェルエレクトロプレート上の任意のウェルに細胞懸濁液のアリコートを150マイクロリットル。
7. MXcellプレートチャンバーのエレクトロポレーションプレートを入れ、蓋を閉じます。
8. 肥満細胞のトランスフェクションに先立ち、エレクトロポレーションプロトコルは、プリセットまたは保存されているプロトコルを使用していない限り、MXcellにプログラムする必要があります。最適化実験を通して、私たちは、肥満細胞の最も高いトランスフェクション効率は、方形波パルスのプロトコルを使用して発生することを発見した。我々は、2000uFと1000オームで300V/20ms、350/15ms、350V/20ms、および350V/10ms方形波パルスを提供するプレート上にエレクトロポレーション条件を変化させます。プロトコルが設定されており、デバイスにロードされた後、細胞をエレクトロに"パルス"を押してください。
9. エレクトロポレーションが完了したら、組織培養プレートに細胞を移す。我々は通常、mLのインターロイキン- 3当たり10ナノグラム、300マイクロリットルRPMI（10％FCS、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびβ-メル​​カプトエタノールを補充した）を含む48ウェル組織培養プレートにウェルにそれぞれ150マイクロリットルのエレクトロポレーションのサンプルを移す。細胞は37℃で一晩インキュベートする° Cは、その後の発現と抑制のために24時間後にアッセイした。

トランsfection結果

プラスミドmLのGFPあたり20マイクログラムを使用して成功したエレクトロポレーション後の細胞の蛍光顕微鏡像をビデオに示されています。約30％のMXcellエレクトロ系のトランスフェクション効率を用いて得ることができる。細胞の生存率を維持しながら、システムは、あなたのトランスフェクション効率を最大化するための条件を変化させることができます。

より多くのゲノム情報が出てくるとこのようなsiRNAなどの新しいツールが開発されるように、生理学的に関連する細胞の使用は、病気の経路、タンパク質 - タンパク質相互作用、及びシグナル伝達の理解を促進するためにこれまで以上に重要になっています。初代細胞は、組織又は体液から直接取得し、in vitroで栽培されている。これらの細胞は、外因性遺伝物質の導入などを通じて、さまざまな方法で操作することができます。それは一次細胞にプラスミドDNAやsiRNAを導入する最も効果的な方法は、エレクトロポレーションであることがますます明らかになってきている。

エレクトロポレーションは、一時的にそれによって外因性核酸は、細胞を入力できるように、細胞膜の透過性を向上させるために電気パルスにセルを公開します。トランスフェクションのこのメソッドは、異なる細胞タイプ/ラインと、このように、マスト細胞をトランスフェクトするために使用できるだけでなく、他の骨髄由来細胞の違いに対応するために最適化することができます。さらに、ウイルスの媒介トランスフェクションとは異なり、エレクトロポレーションはトランスフェクトしたDNAのサイズに制限があります、また大規模な準備を必要としません。脂質媒介トランスフェクションとは対照的に、エレクトロポレーションは、毒性の低いことができ、トランスフェクトされた核酸のエンドソーム捕捉されることはありません。

バイオラッドは、これらの細胞のために特別にMXcellのエレクトロポレーションシステムを開発しました。 MXcellは、あなたのトランスフェクション効率と細胞生存率を最大化するための条件を変化させることができます。トランスフェクション効率を最適化し、細胞死を最小限にするためには、電圧、キャパシタンス、抵抗、およびパルス長を含むエレクトロポレーションパラメータの多数を調整し、評価することができます。

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