Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).

Сбор костного мозга от бедра и голени

1. Первый этап процедуры для сбора костного мозга от бедра и голени 6 - на 12-недельных мышей (мы используем BALB / с мышами, но вы можете сделать эту процедуру с любым мыши деформации). Во-первых, усыпить мыши СО ₂ ингаляции (не будет показан). Урожай бедра и голени от задних ног каждого из них. Затем, с лезвием, разрезать каждый конец бедренной кости для удаления тазобедренных и коленных суставах и разоблачить мозга.
2. Таким же образом, сократить каждом конце голени, чтобы удалить коленного и голеностопного прилегающих районов и разоблачить мозга.
3. Возьмите 3 мл шприц с 26-иглы и залейте его RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанола (BME = 100 мкм). С помощью пинцета держать кости более чашки Петри содержащей RPMI СМИ. Вставьте иглу шприца в один конец кости и нажмите поршень, чтобы избавиться от костного мозга. Иглу шприца можно перемещать вверх и вниз внутри кости, чтобы избавиться от остаточных мозга.
4. Повторите процедуру для всех костей, а затем продолжить создание культур.

Создание культур

1. Установить кости культур мозга, пипетки вспыхнул костного мозга вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить ткани в клеточной суспензии.
2. Место 70 микрон фильтр на вершине 50 мл коническую трубку, и добавить клеточной суспензии в фильтр.
3. Полоскание чашки Петри одно время с RPMI, а затем добавить промыть в фильтре 70 мкм.
4. Использование резиновых конце 1 мл шприца, перемалывать кости частей мозга, оставшиеся на начало 70-микронный фильтр.
5. Промойте фильтр один раз с RPMI.
6. После промывки фильтров, центрифуг клеточной суспензии при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
7. Промыть осадок клеток путем суспендирования в PBS.
8. Граф клеток с использованием гемоцитометра. Как правило, мы получаем ~ 90 миллионов клеток из костей одним кликом (две бедренные кости и две голени). После подсчета клеток, центрифуги их снова при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
9. Ресуспендируют клетки в небольшом количестве RPMI и аликвоту их в культуре ткани колбы, содержащие достаточно RPMI так, чтобы конечная концентрация составляет 1 млн. клеток в мл.
10. Добавить цитокинов способствовать развитию вашего типа клеток, представляющих интерес. В этом случае, цитокина интерлейкина-3 (IL-3 = 10 нг / мл) в целях содействия развитию базофилов и тучных клеток. Для приобретения базофилов, инкубировать в течение 10 дней. Для тучных клеток, инкубировать в течение 5 недель. При создании тучных клеток, средств массовой информации и IL-3 должен быть изменен раз в неделю.
11. Вот посмотрите, как тучные клетки должны появиться сразу после металлизации. Это изображение показывает дифференциацию тучных клеток мозга в базофилов и тучных клеток через 10 дней после того интерлейкина-3.
12. Как только желательный тип клеток получается, переходите к шагу электропорации.

Клетки Electroporating

1. Для начала электропорации шаг, определить количество клеток в культуре колбу.
2. Клетки, как правило, электропорации при плотности 10 миллионов в мл, поэтому передача необходимого количества ячейки конических труб и труб центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
3. После центрифугирования, аспирация СМИ, мыть клетки с 1X PBS, и вновь центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут.
4. Аспирируйте PBS и добавьте Bio-Rad Гена Pulser электропорации буфера, чтобы сделать клеточную суспензию из 10 миллионов клеток на мл.
5. После ресуспендирования клеток, добавьте нужные ДНК плазмиды в конечной концентрации от 10 до 20 мкг на мл.
6. Алиготе 150 мкл суспензии клеток в лунки свой выбор на 96-луночного электропорации пластины.
7. Положите электропорации пластины в камере пластины MXcell и закрыть крышкой.
8. До трансфекции тучных клеток, электропорации протокол должен быть запрограммирован в MXcell за исключением использования предустановок или хранится протокол. Благодаря оптимизации экспериментов мы обнаружили, что высокая эффективность трансфекции тучных клеток происходит с помощью квадратных протоколов пульсовой волны. Мы будем меняться электропорации условий на пластине для доставки 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms и 350V/10ms импульсов прямоугольной волны в конденсатор на 2000мкФ и 1000 Ом. Как только протокол был установлен и загружен на устройства, нажмите «Пульс», чтобы electroporate клеток.
9. После электропорации завершения передачи клеткам планшета для культуры ткани. Как правило, мы передачи по 150 мкл электропорации образец хорошо в 48-луночного культуре ткани пластину, содержащую 300 мкл RPMI (с добавлением 10% FCS, пенициллин, стрептомицин, и бета-меркаптоэтанол) с 10 нанограмм на мл интерлейкина-3. Клетки инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С, затем анализировали через 24 часа для выражения мнения и подавление.

ТранРезультаты sfection

Флуоресцентное изображение микроскопии клеток после успешного электропорации с использованием 20 мкг на мл GFP плазмиды показан на видео. Использование электропорации MXcell системы трансфекции эффективности около 30% могут быть получены. Система позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции, сохраняя жизнеспособность клеток.

Поскольку все больше появляется геномной информации и новые инструменты, такие как миРНК разработаны, применение физиологически соответствующие клетки становится все более важным дальнейшее наше понимание болезни путей, белок-белковых взаимодействий и передачи сигнала. Первичные элементы получаются непосредственно из ткани или жидкости и культивируемых в лабораторных условиях. Эти клетки можно манипулировать различными способами, в том числе путем введения экзогенного генетического материала. Становится все более очевидным, что наиболее эффективным способом введения плазмидной ДНК или миРНК в первичные клетки электропорации.

Электропорация выставляет клетках в электрические импульсы для того, чтобы временно увеличивают проницаемость клеточных мембран, тем самым позволяя экзогенных нуклеиновых кислот, чтобы войти в камеру. Этот метод трансфекции может быть оптимизирована, чтобы учесть различия между различными типами клеток / линии и, таким образом, могут быть использованы для трансфекции тучных клеток, а также любые другие костномозгового происхождения клетки. Кроме того, в отличие от вирусного-опосредованной трансфекции, электропорации не накладывает ограничений на размер трансфекции ДНК, не требуют серьезной подготовки. В отличие от липидных-опосредованной трансфекции, электропорации может быть менее токсичны и не приводит к эндосом захвата трансфекции нуклеиновых кислот.

Bio-Rad разработана система MXcell электропорации специально для этих клеток. MXcell позволяет варьировать условия для максимальной эффективности трансфекции и жизнеспособности клеток. В целях оптимизации эффективности трансфекции и свести к минимуму гибель клеток, множество параметров, включая электропорации напряжения, емкости, сопротивления и длительности импульса можно регулировать и оценивать.

4 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.