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 JoVE Biology

主电穿孔的小鼠骨髓造血细胞培养制备

1, 1, 1

1Gene Expression Division, Bio-Rad Laboratories, Inc

Article
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    Summary

    此过程介绍了如何建立从小鼠骨髓造血的主要细胞培养和使用转基因脉冲MXCell电系统。

    Date Published: 1/06/2009, Issue 23; doi: 10.3791/1026

    Cite this Article

    Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).

    Abstract

    这是越来越明显,电是最有效的方法,引入的原代细胞的质粒DNA或siRNA。基因脉冲MXcell电系统和基因脉冲电缓冲区是专门开发核酸转染哺乳动物细胞和难以转染的细胞,如小学和干cells.This视频,演示了如何建立从小学小鼠骨髓造血细胞培养,然后准备在MXcell系统的电。我们开始通过分离股骨和胫骨。从股骨和胫骨的骨髓,然后收获和文化都成立。培养的骨髓细胞,然后转染和分析。

    Protocol

    收获从股骨和胫骨骨髓

    1. 该过程的第一步是,收获从6股骨和胫骨骨髓 - 12周龄小鼠(我们使用的是BALB / c小鼠,但你可以用此过程中,任何小鼠品系)。首先,安乐死的CO 2吸入(将不会被显示)鼠标。收获从每个后腿股骨和胫骨。然后,用刀片,切删除的髋关节和膝关节股骨的两端,暴露骨髓。
    2. 以类似的方式,削减的胫骨的两端删除膝,踝关节的邻近地区,并揭露了骨髓。
    3. 以26号针头与3毫升注射器和填充用RPMI 10%胎牛血清,青霉素,链霉素,和β-巯基乙醇(BME = 100 UM)的补充。使用镊子,缓缴的Petri菜的RPMI媒体骨。骨的一端插入注射器针头,压低柱塞冲洗出骨髓。注射器针头,可以向上和向下移动,骨内,以冲洗掉残留骨髓。
    4. 重复的过程中,所有的骨头,然后着手建立的文化。

    建立文化

    1. 要建立的骨髓文化,吸刷新骨髓几次分手组织成细胞悬液。
    2. 50 mL锥形管上放置一个70微米的过滤器,过滤器,并添加细胞悬液。
    3. 冲洗培养皿中,用RPMI一次,然后添加到70微米的过滤器冲洗。
    4. 使用1 mL注射器柱塞橡胶年底,磨70微米的过滤器上的剩余的骨髓片。
    5. 用RPMI清洗一次过滤器。
    6. 清洗过滤器后,在5分钟1200转离心细胞悬液。
    7. resuspending在PBS清洗细胞沉淀。
    8. 使用血球计数细胞。我们通常会获得从一只老鼠的骨骼(两股骨加两个胫骨)〜90亿个细胞。细胞计数后,他们再次在5分钟1200转离心。
    9. 重悬在少量的RPMI和分装到含有足够的RPMI使终浓度为每毫升1万细胞的组织培养瓶中细胞。
    10. 添加细胞因子,促进发展您感兴趣的细胞类型。在这种情况下,添加细胞因子白细胞介素3(IL - 3 = 10毫微克/毫升)嗜碱性粒细胞和肥大细胞,促进发展。为了获得嗜碱性粒细胞,孵育10天。对于肥大细胞,培育5个星期。当生成肥大细胞,媒体和IL - 3,应每周更换一次。
    11. 这里是在肥大细胞应如何电镀后出现。这个图像演示肥大骨髓细胞嗜碱性粒细胞和肥大细胞后10天白细胞介素- 3除了的分化。
    12. 一旦获得所需的细胞类型,进行电一步。

    电穿孔细胞

    1. 要开始的电击一步,决定在培养瓶中的细胞数量。
    2. 细胞通常在电穿孔密度每毫升10万,转移所需的细胞数量,锥形管,并在5分钟1200转离心管。
    3. 离心后,吸媒体,用1X PBS清洗细胞,并再次离心5分钟1200转。
    4. 吸出PBS和添加Bio - Rad公司的基因脉冲电缓冲区,使细胞每毫升10万的细胞悬液。
    5. resuspending的细胞后,加入终浓度在10至20微克每毫升所需的质粒DNA。
    6. 分装150微升到您所选择的井的细胞悬液,在96孔的电板。
    7. MXcell板室的电板,并盖上盖子。
    8. 肥大细胞的转染之前,必须编程电协议进入的MXcell,除非使用预设或存储协议。通过优化实验,我们发现,肥大细胞的转染效率最高发生使用方波脉冲协议。我们将根据板的电条件,提供300V/20ms,350/15ms,350V/20ms和350V/10ms方波脉冲,在2000uF和1000欧姆。一旦协议已经设置并加载到设备上,按“脉冲”electroporate细胞。
    9. 电完成后,转移到组织培养板的细胞。我们通常将每个150微升电样品以及一个48孔组织培养板与白细胞介素- 3每毫升10毫微克含300微升的RPMI(含10%FCS,青霉素,链霉素,和β-巯基乙醇补充)。细胞孵育过夜在37 ° C,然后在24小时后测定表达和抑制。

    陈德良sfection结果

    成功后,使用质粒GFP的每毫升20微克的电的细胞的荧光显微镜图像显示视频。可使用MXcell电系统的大约30%的转染效率。该系统使您可以改变条件,最大限度地提高您转染效率,同时保持细胞活力。

    Discussion

    随着越来越多的基因组信息的出现,并开发新的工具,如siRNA的,使用的有关生理细胞已变得越来越重要,我们进一步了解疾病的途径,蛋白 - 蛋白相互作用和信号转导。主要细胞是直接从组织或体液,并在体外培养。方式,包括通过引入外源遗传物质,这些细胞可以被操纵。这是越来越明显,引入的原代细胞的质粒DNA或siRNA的最有效的方法是电击。

    电穿孔公开细胞电脉冲,以瞬时提高细胞膜的通透性,从而使外源核酸进入细胞。这种转染的方法,可以优化,以适应不同类型的细胞/线,因此,可用于转染肥大细胞,以及任何其他骨髓衍生的细胞之间的差异。此外,与病毒介导的转染,电不转染DNA的大小施加限制,也不需要大量的准备。相比之下脂质介导的转染,电可以毒性较低,不会导致转染的核酸内体诱捕。

    Bio - Rad公司已经开发出了MXcell电系统,专门为这些细胞。 MXcell允许您以不同条件,最大限度地提高您转染效率和细胞活力。为了优化转染效率和减少细胞死亡,众多的电参数,包括电压,电容,电阻,脉冲长度可以调整和评估。

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gene Pulser MXcell Electroporation System Bio-Rad 165-2670
    Gene Pulser Electroporation Buffer Bio-Rad 165-2677

    Comments

    7 Comments

    Hello Is it also possible to get endothelial cells with this protocol?If yes, will they be endothelial progenitor cells or fully diferentiated endothelial cells?   Thanks   João Switzerland
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 20, 2009, 5:24 AM

    during electroporation, the plasmid concentration that you mentioned was 10-²0 micrograms per ml final concentration. dŒs this mean this is concentration of plasmid in 1ml of cells or one should use that concentration of DNA in 1ml of water and mix with 1 ml of cells with buffer?

    thanks

    murali
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 9, 2009, 10:56 AM

    I am not able to spread out BHK²1 cells evenly on 6 well plate. Transfection efficiency of Lipofectin mediated transfection is poor 15-²0 percent. how do i improve trnansfection efficiecny?
    Thanks
    Shilpa India
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 14, 2010, 3:37 AM

    What is the maximum time that can lapse between euthanasia and harvesting bone marrow
    Reply

    Posted by: p t.October 8, 2012, 6:57 PM

    Hello, There is no set time limit, but you need to work as quickly as possible. Within minutes of animal death cells start to die. The longest prep was estimated ~60 minutes to isolate.
    Reply

    Posted by: Michelle C.October 9, 2012, 1:56 PM

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