La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l'électroporation

Kroeger, K., Collins, M., Ugozzoli, L. The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation. J. Vis. Exp. (23), e1026, doi:10.3791/1026 (2009).

La récolte de moelle osseuse provenant fémurs et tibias

1. La première étape de la procédure est de récolter la moelle osseuse dans le fémur et le tibia d'un 6 - à 12 semaines vieille souris (nous utilisons souris Balb / c, mais vous pouvez faire cette procédure avec toute souche de souris). Pour commencer, euthanasier la souris par inhalation de CO ₂ (ne sera pas montré). Fémur et tibias Récolte de la pattes postérieures de chacun. Puis, avec une lame de rasoir, couper chaque extrémité des fémurs d'enlever la hanche et du genou et d'exposer la moelle.
2. De la même manière, couper chaque extrémité du tibia pour enlever le genou et la cheville régions adjacentes et d'exposer la moelle.
3. Prendre une seringue de 3 ml avec une aiguille de calibre 26 et de le remplir avec RPMI supplémenté avec 10% de FBS, la pénicilline, la streptomycine et le bêta-mercaptoéthanol (BME = 100 UM). En utilisant une pince à épiler, tenez l'os au cours d'une boîte de Petri contenant un milieu RPMI. Insérez l'aiguille de la seringue dans une extrémité de l'os et appuyer sur le piston pour chasser la moelle osseuse. L'aiguille de la seringue peut être déplacé de haut en bas dans l'os pour débusquer la moelle résiduelle.
4. Répétez la procédure pour tous les os, puis procéder à l'établissement des cultures.

Établir des cultures

1. Pour établir les cultures de moelle osseuse, une pipette de la moelle osseuse rincée de haut en bas plusieurs fois pour briser le tissu dans une suspension cellulaire.
2. Placer un filtre de 70 microns au-dessus d'un tube conique de 50 ml, et ajouter la suspension de cellules sur le filtre.
3. Rincez les boîtes de Pétri une fois avec du RPMI, puis ajouter l'eau de rinçage à l'filtre 70 microns.
4. Utilisation de l'extrémité en caoutchouc d'un plongeur 1 ml seringue, broyer les morceaux de moelle osseuse restent sur le dessus du filtre de 70 microns.
5. Lavez le filtre une fois avec du RPMI.
6. Après le lavage du filtre, centrifuger les cellules en suspension à 1200 rpm pendant 5 minutes.
7. Laver le culot cellulaire par remise en suspension dans du PBS.
8. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Nous obtiennent généralement ~ 90 millions de cellules à partir des os d'une souris (deux fémurs et deux tibias). Après avoir compté les cellules, les centrifuger à 1200 rpm pendant 5 minutes.
9. Resuspendre les cellules dans une petite quantité de RPMI et aliquot eux dans des flacons de culture de tissus contenant suffisamment de RPMI sorte que la concentration finale est de 1 million de cellules par mL.
10. Ajouter des cytokines de promouvoir le développement de votre type de cellule d'intérêt. Dans ce cas, la cytokine interleukine-3 (IL-3 = 10 ng / ml) est ajoutée à promouvoir le développement des basophiles et les mastocytes. Pour acquérir les basophiles, incuber pendant 10 jours. Pour les mastocytes, les incuber pendant 5 semaines. Lors de la génération des mastocytes, les médias et l'IL-3 devrait être changé une fois par semaine.
11. Voici un aperçu de la façon dont les mastocytes devrait apparaître juste après placage. Cette image montre la différenciation des cellules de la moelle mât dans les basophiles et les mastocytes 10 jours après l'ajout d'interleukine-3.
12. Une fois le type de cellule désiré est obtenu, passez à l'étape électroporation.

Cellules électroporation

1. Pour commencer l'étape d'électroporation, déterminer le nombre de cellules dans le flacon de culture.
2. Les cellules sont généralement électroporation à une densité de 10 millions par ml, alors le transfert le nombre de cellules nécessaires pour tubes coniques et centrifuger les tubes à 1200 tpm pendant 5 minutes.
3. Après centrifugation, aspirer les médias, se laver les cellules avec du PBS 1X et centrifuger à nouveau à 1200 rpm pendant 5 minutes.
4. Aspirer le PBS et ajouter de Bio-Rad tampon Gene Pulser électroporation de faire une suspension cellulaire de 10 millions de cellules par mL.
5. Après remise en suspension des cellules, ajouter de l'ADN plasmidique désiré à une concentration finale de 10 à 20 microgrammes par ml.
6. Aliquoter 150 microlitres de la suspension cellulaire dans des puits de votre choix sur une plaque de 96 puits électroporation.
7. Mettez la plaque électroporation dans la chambre de la plaque MXcell et fermer le couvercle.
8. Avant de transfection de cellules de mât, un protocole d'électroporation doit être programmé dans le MXcell à moins d'utiliser un protocole prédéfini ou stockées. Grâce à des expériences d'optimisation que nous avons découvert que l'efficacité de la transfection de cellules haute du mât se produisent en utilisant des protocoles carrés onde de pouls. Nous allons modifier les conditions d'électroporation sur la plaque de livrer 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms, et des impulsions d'ondes carrées 350V/10ms au condensateur 2000uF et 1000 ohms. Une fois le protocole a été établi et chargé sur le périphérique, appuyez sur «Pulse» pour électroporer les cellules.
9. Après électroporation est terminée, le transfert des cellules sur une plaque de culture de tissus. Nous généralement transférer chaque échantillon de 150 microlitre électroporation à un puits dans une plaque de 48 puits de culture de tissu contenant 300 microlitres RPMI (complété avec 10% de FCS, la pénicilline, la streptomycine et le bêta-mercaptoéthanol) avec 10 nanogrammes par ml d'interleukine-3. Les cellules sont incubées une nuit à 37 ° C, puis dosée 24 heures plus tard, d'expression et de répression.

TranRésultats sfection

L'image de microscopie à fluorescence des cellules après l'électroporation réussie en utilisant 20 microgrammes par ml GFP plasmide est montré dans la vidéo. Utilisation de l'efficacité MXcell électroporation système de transfection de l'ordre de 30% peut être obtenue. Le système vous permet de varier les conditions afin de maximiser votre efficacité de la transfection, tout en maintenant la viabilité cellulaire.

Comme plus d'informations génomiques émerge et de nouveaux outils tels que siARN sont développés, l'utilisation de cellules physiologiquement pertinente est devenue de plus en plus important d'approfondir notre compréhension des voies de la maladie, interactions protéine-protéine, et la transduction du signal. Les cellules primaires sont obtenues directement à partir de tissus ou les liquides et cultivées in vitro. Ces cellules peuvent être manipulés dans un certain nombre de façons, notamment par l'introduction de matériel génétique exogène. Il est de plus en plus évident que la façon la plus efficace pour introduire de l'ADN plasmidique ou siRNA dans des cellules primaires est l'électroporation.

L'électroporation expose les cellules à des impulsions électriques de manière à transitoirement augmenter la perméabilité de la membrane cellulaire, permettant ainsi aux acides nucléiques exogènes pour entrer dans la cellule. Cette méthode de transfection peut être optimisée pour accueillir les différences entre les différents types de cellules / lignes et, par conséquent, peuvent être utilisés pour transfecter des cellules de mât ainsi que tout autre os de cellules dérivées de la moelle. Par ailleurs, contrairement virale médiée par transfection, l'électroporation n'impose pas de limites sur la taille de l'ADN transfecté, ni exiger une préparation importante. Contrairement aux lipides transfection médiée, l'électroporation peut être moins toxique et n'entraîne pas de piégeage de l'acide endosomal transfectées nucléiques.

Bio-Rad a développé le système d'électroporation MXcell spécifiquement pour ces cellules. l'MXcell vous permet de varier les conditions afin de maximiser votre efficacité de la transfection et la viabilité cellulaire. Afin d'optimiser l'efficacité de transfection et de minimiser la mort cellulaire, une multitude de paramètres, y compris l'électroporation de tension, capacité, résistance et durée d'impulsion peut être réglée et évalués.

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