Modelo murino de isquemia Miembro Posterior

Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine Model of Hindlimb Ischemia . J. Vis. Exp. (23), e1035, doi:10.3791/1035 (2009).

En los Estados Unidos, la enfermedad arterial periférica (EAP) afecta a alrededor de 10 millones de personas en todo el mundo y es también frecuente. Tratamientos médicos para el alivio sintomático son limitados. Intervenciones quirúrgicas o endovasculares son útiles para algunas personas, pero a largo plazo resultados suelen ser decepcionantes. Como resultado, existe una necesidad para el desarrollo de nuevas terapias para tratar la enfermedad arterial periférica. La preparación miembro posterior isquemia es un modelo murino de la PAD, y es útil para probar nuevas terapias. Cuando se compara con otros modelos de isquemia tisular, tales como la ligadura de la arteria coronaria o cerebral, ligadura de la arteria femoral establece un modelo más simple de los tejidos isquémicos. Otras ventajas de este modelo son la facilidad de acceso a la arteria femoral y la baja tasa de mortalidad.

En este video, se demuestra la metodología para el modelo murino de isquemia hindimb unilateral. Los materiales y procedimientos específicos para la creación y la evaluación del modelo se describe, incluyendo la evaluación de la perfusión de un miembro por láser Doppler. Este protocolo también puede ser utilizado para el trasplante y el seguimiento no invasivo de las células, lo cual es demostrado por Huang et al. ^1.

1. La inducción de isquemia Miembro Posterior Unilateral

1. El instrumental quirúrgico necesario para esta operación son: pinzas finas puntas, pinzas de punta, tijeras de primavera, tijeras quirúrgicas, porta agujas, y el retractor. Hacemos nuestro propio retractor con un clip, ya que es más pequeño que los retractores disponibles en el mercado. Esterilizar las herramientas antes de la cirugía por un autoclave o esterilizador de calor de perlas. Una herramienta de cauterización y estéril bastoncillos de algodón señaló también serán necesarios para esta cirugía. Se recomienda que las herramientas de ser re-esterilizados en las puntas cuando sea necesario durante el procedimiento.
2. Cuando los instrumentos están listos, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min.
3. Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano.
4. A continuación, coloque el animal en decúbito supino sobre la mesa antes de la operación y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Usando una máquina de afeitar eléctrica, eliminar el vello de las extremidades inferiores. Aplicar crema de depilación para eliminar completamente el cabello.
5. Coloque el ratón en la posición de decúbito supino sobre una toalla envuelta con calefacción en la mesa de operaciones, y conectarlo a un flujo continuo de isoflurano. Ampliar y asegurar la extremidad posterior con un pedazo de cinta adhesiva. Una vez que el miembro posterior es segura, limpia la piel con tres alterna matorrales Betadine y alcohol. Para el resto del procedimiento quirúrgico, el uso de un microscopio de disección a 10X o 20X de aumento para obtener una vista ampliada de la región de las extremidades traseras.
6. Con unas pinzas finas y tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de la piel, de aproximadamente 1 cm de largo, desde la rodilla hacia el muslo.
7. Utilizando tampón fosfato salino (PBS)-humedecido bien hisopos de algodón señaló, cepille suavemente el tejido graso subcutáneo que rodea el músculo del muslo.
8. A continuación, aplicar el cauterio para incidir transversalmente y disecar a través del tejido graso subcutáneo para revelar la arteria femoral subyacente.
9. Use un separador para abrir la herida y para obtener una mejor visión de los vasos de las extremidades inferiores.
10. Con unas pinzas finas y un hisopo de algodón en punta, suavemente atravesar la vaina femoral membranosa para exponer el paquete neurovascular.
11. Luego, utilizando un juego limpio de fórceps y un hisopo de algodón, analizar y separar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio en la posición proximal cerca de la ingle. Después de la disección, pasar un hilo de sutura de seda 7-0 por debajo del extremo proximal de la arteria femoral. Ocluir la arteria femoral proximal con nudos dobles. Coloque el empate en el buque como proximal en la herida como sea posible a fin de dejar de longitud para el segundo empate y un segmento intermedio que se secciona.
12. Separada de la arteria femoral de la vena femoral en la posición distal cerca de la rodilla. Pase un hilo de sutura de 7-0 por debajo del extremo distal de la arteria femoral proximal de la arteria poplítea. Ocluir el vaso con nudos dobles.
13. Ocluir la arteria femoral distal con un segundo conjunto de nudos dobles proximal a la primera serie de nudos. Este segundo conjunto de puntos de sutura se utiliza para el agarre de la arteria durante el procedimiento de transacción.
14. Del mismo modo, a los efectos de agarre, ocluir la arteria femoral proximal con un segundo conjunto de nudos dobles justo distal a la primera serie de nudos.
15. Seccionar el segmento de la arteria femoral entre los nudos distales y proximales con un hisopo de algodón de punta fina y un par de tijeras de primavera. Tenga cuidado de no perforar la pared de la vena femoral.
16. Retire el separador y cerrará la incisión con puntos de sutura Vicryl 5-0. Estas suturas no necesitan ser removidos en un momento posterior, ya que se disuelven por sí mismos.
17. Una vez que se cierra la incisión, el lugar del animal en la parte superior de un cojín cubierto con calefacción en la jaula de recuperación y seguimiento de forma continua hasta que despierto.
18. Después de animal se ha recuperado de una hora, continúe con el paso de láser Doppler perfusión de la sangre con el fin de confirmar la inducción de isquemia.

2. Laser Doppler perfusión de la sangre

1. Para comenzar la etapa de láser Doppler perfusión, coloque el ratón en la cámara de inducción de la anestesia que contiene un 1-3% de isoflurano en oxígeno al 100%, con un caudal de 1L/min.
2. Deja el ratón en la cámara de inducción hasta que no responde a los estímulos externos. A continuación, retire el animal de la cámara de inducción. Se recomienda para eliminar la anestesia de la caja antes de abrir la tapa, para disminuir la exposición del operador con el isoflurano.
3. Colocar el animal sobre la mesa pre-operativos relacionados con el flujo continuo de isoflurano. A continuación, eliminar el vello de las extremidades inferiores con una afeitadora eléctrica seguida por la crema del retiro del pelo si es necesario.
4. Después de quitar el pelo,Colocar el animal en una superficie de 37 ° C se calienta durante 5 minutos con un flujo continuo de isoflurano. Monitorear la temperatura del núcleo para asegurar euthermia, como los cambios de temperatura afectan notablemente la perfusión.
5. Después de 5 minutos, coloque el animal en decúbito supino sobre una base no-reflectante que absorben la luz de superficie como de color verde de tela, conectado a un flujo continuo de isoflurano. Extender las extremidades posteriores.
6. A continuación, encienda la impresora láser Doppler y la adquisición de software e inicializar el software. Especificar el tamaño del campo de visión y resolución. Lo mejor es mantener el campo de visión y la densidad de píxeles consistente entre los animales con el fin de realizar análisis en el futuro sea más fácil.
7. Abra un archivo nuevo. Pulse inicio para comenzar a adquirir los datos de imagen. En general, la cámara detecta automáticamente la distancia con el ratón, pero si se le solicita, especifique la distancia del animal a la cámara. El láser se muestran los límites del campo de visión y luego iniciar la adquisición de datos.
8. Después de la adquisición se haya completado, la imagen empieza a mostrar una gama de colores que indican el nivel de perfusión de la sangre a las piernas. Los colores se pueden establecer en un rango de perfusión específicas para una mejor comparación de datos entre los animales.
9. Cuando la adquisición de datos, guarde el archivo.
10. A continuación, devolver el animal a la jaula de recuperación y seguimiento de los animales continuamente hasta que despierto.
11. Para analizar los datos, use el ajuste de umbral en el software de análisis para restar el ruido de fondo. Un umbral de 0,2 suele ser un valor razonable. Seleccione dos regiones de interés o rendimiento de la inversión, que cubren cada área de las extremidades traseras. Una variedad de puntos de referencia se pueden utilizar para normalizar el retorno de la inversión entre los miembros y los animales. A continuación, determinar el promedio de perfusión y la variabilidad en el retorno de la inversión. La diferencia de perfusión y la relación entre la perfusión de la extremidad isquémica y la integridad física de control entonces se puede determinar fácilmente.
12. Este procedimiento se puede repetir para seguir los cambios en la perfusión de extremidades inferiores en el tiempo. En un momento de tiempo deseado, el animal puede ser sacrificado para la evaluación de la función del tejido y la comparación de datos de imágenes de perfusión.

3. Los resultados representativos:

La anatomía de la vasculatura extremidades inferiores se muestra en la Figura 1 ^2. Un esquema representativo de las extremidades inferiores después de la explantación arteria femoral se muestra en la Figura 2. Para confirmar la inducción de isquemia de las extremidades inferiores, láser Doppler de análisis de imágenes de perfusión demuestra una reducción drástica en el flujo de sangre a la extremidad isquémica, en comparación con la rama de control, como se muestra en la Figura 3.

Figura 1. Anatomía de la vasculatura extremidades inferiores. Los asteriscos indican la ubicación de la ligadura de la inducción de isquemia extremidades inferiores.

Figura 2. Esquema representativo que muestra la anatomía de las extremidades inferiores después de la ligadura de la arteria femoral en los sitios proximal y distal después de la eliminación de la arteria femoral.

Figura 3. Laser Doppler imágenes que muestran el flujo de sangre antes y después de la inducción de isquemia de la extremidad posterior izquierda (indicado por la flecha).

Hay algunas fuentes de variabilidad a considerar al planear y ejecutar modelos de isquemia extremidades inferiores. En primer lugar, el nivel de la isquemia puede variar de acuerdo a la ubicación de la ligadura con respecto a la de las ramas laterales. Por lo tanto, para mantener la coherencia del modelo, los animales deben ser sometidos a un mismo nivel de la ligadura arterial. Otra fuente de variabilidad en la recuperación isquémica está relacionada con la edad de los animales, con animales jóvenes (6-8 semanas de edad) que tengan más rápida y completa recuperación de las tasas que los animales mayores (8-10 meses), según la evaluación hemodinámica (es decir, láser Doppler perfusión) o funcionales (es decir, prueba de esfuerzo) las medidas. Para los estudios en los que uno está evaluando un agente angiogénico, puede ser preferible utilizar animales de más edad, debido a una mayor diferencia entre los grupos se pueden observar con una intervención terapéutica. Por el contrario, para los estudios en los que uno está evaluando un factor anti-angiogénico, puede ser preferible utilizar los animales más jóvenes para maximizar el efecto del tamaño de ^tres.

Si se realiza correctamente, debería haber un mínimo de complicaciones tales como sangrado, infección, o la mortalidad. Si se produce una hemorragia por la ruptura accidental de la vena femoral o de otros buques, una presión moderada con un algodón estéril con punta de aplicador o gasa debe ser aplicada en el sitio de la hemorragia hasta que el sangrado se detenga. Los animales que presenten signos de infección debe ser tratada con agentes anti-infecciosos. Los animales presentan gangrena significativa posible que tenga que beeuthanized. Esta complicación es más frecuente en los animales, y en algunas cepas, como los ratones BALB c ^4. Además, el modelo de isquemia extremidades inferiores pueden causar dolor leve a moderado. Por lo tanto, los analgésicos como la buprenorfina o carprofeno se debe administrar como sea necesario para el tratamiento del dolor, de acuerdo con las recomendaciones de la IACUC.

En conclusión, hemos demostrado un método simple y reproducible para el estudio de la PAD en un modelo murino de isquemia extremidades inferiores. El modelo de isquemia miembro posterior con láser Doppler de análisis de imágenes es un excelente sistema para el estudio de patologías vasculares y para la evaluación de candidatos terapéuticos.

Los autores agradecen a Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Velotta Jeff, MD, Hoyt Grant, Robert C. Robbins, MD, Yu Jin, MD, Tim Doyle, PhD, y el Stanford pequeño núcleo de imágenes de animales para la asistencia técnica. Los autores también agradecen AM Bickford, Inc. para el apoyo del equipo de veterinarios. Esta investigación fue financiada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), el tabaco de California las enfermedades relacionadas con el Programa de Investigación de la Universidad de California (15IT-0257 y 0169-1514RT) , y el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RS1-00183). NH es apoyado por una beca de la Asociación Americana del Corazón.

1. Huang, N.F., Niiyama, H., De, A., & Cooke, J.P. Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia. JoVE (2008).
2. Cook, M.J. The anatomy of the laboratory mouse. Academic Press, New York (1976).
3. Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., & Imaizumi, T. Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization. J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-6 (2004).
4. Dokun, A.O, Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G.M., Wheeler, F., Marchuk, D.A., & Annex, B.H. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-15 (2008).

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