Fura - 2 오전 사용하여 두피 뉴런의 칼슘 이미징

세포 배양

전지는 기존 기술을 사용하여 성장 수 있지만 이미징 실험을하는 동안 분리 또는 이동에서 세포를 방지하기 위해 세포 접착제 (polylysine, polyornithine 또는 laminin과 같은)과 코팅 # 1 유리 coverslips에 도금해야합니다.

솔루션

칼슘 이미징 실험은 세포 배양 매체를 포함하여 생리 솔루션의 다양한 사용하여 수행할 수 있습니다. 이것은 솔루션이 크게 형광 배경을 증가 페놀 레드, 무료되었는지 확인하기 위해, 그러나, 중요합니다. 우리가 쉽게 만들어 뇌척수를 모방하고, 우리가 알부민 0.1 % 소 혈청 그것을 보충합니다 Tyrodes 솔루션을 사용합니다. 우리는 가게 운영 CRAC 채널을 활성화하기 위해 전압 게이 티드 칼슘 채널과 1μM Thapsigargin (DMSO 1 MM 재고) 또는 2μM Ionomycin (DMSO 1 MM 주식)을 활성화 60-90 MM 염화칼륨과 탈분극을 사용합니다. 그것은 칼슘 고도는 칼슘 유입에 의한 것을 표시하는 세포외 용액에서 칼슘을 제거하는 것이 편리합니다. 칼슘을 제거하면 그것은 이가의 양이온의 총 농도 (MG ² + 및 CA ² +) 상수.을 유지하기 위해 필요합니다 나트륨에 대한 칼륨을 대체하면 그것은 삼투 균형을 유지하기 위해 필요합니다.

Tyrodes 솔루션 :

NaOH와 7.4으로 산도를 조정

Fura - 2 칼슘 염료의 로딩

우리와 함께 세포를로드 acetoxy - 메틸 에스테르 Fura - 2 세포막에 걸쳐 diffuses 및 Fura - 2 무료 산성을 나타낼 세포 esterases로 드 esterified입니다 (Fura - 2 AM). Fura - 2 로딩에 대한 정확한 매개 변수는 세포 종류에 걸쳐 광범위하게 다릅니다. 4 μm의 15 2 시간 분 실온에서로드 테스트에서 시대의 다양한 로딩 솔루션 세포를 잠복기하고 - 우리는 1에서 성난 Fura - 2의 여러 농도를 포함하는 여러 로딩 솔루션을 준비하여 다양한 조건을 테스트하는 것이 좋습니다 37 데그에서. 대뇌 피질의 뉴런에 단순 프로토콜은 아래 주어집니다 :

1. 첫째, Invitrogen에서 사용할 수 50μg 유리병에 DMSO의 50μl를 추가하여 Fura - 2 AM 재고가 1 ㎜를 준비합니다. 그것을 질소하에 포장 건조 DMSO를 사용하는 것이 중요하고 그것은 DMSO의 수화을 방지하기 위해 심장을 펑쳐링하여 바늘로 DMSO를 제거하는 것이 필요합니다. 준비 후 Fura - 2 오전 솔루션은 어두운 건조한 장소에 보관하십시오. Fura - 2는 24 시간 동안 RT에서 DMSO에 안정 오전에 안정 - 몇 개월 동안 건조한 용기에 20도.
2. 37 데그에 따뜻한 15 ML 원뿔 튜브로 문화 미디어 나누어지는 두 MLS. 및 Fura - 2의 2μl을 추가 Fura - 2 AM 솔루션 1μM를 생성 재고입니다. 1 분 적극적으로 소용돌이 솔루션입니다.
3. 35mm 조직 문화 요리에 로딩 솔루션을 전송하고 접시에 세포로 coverslip을 전송.
4. 어두운 인큐베이터에서 30 분 동안 37도에서 뉴런을 품어. 부화 정확하게 시간.
5. Fura - 2 AM없이 조직 문화 미디어 2 MLS를 포함하는 35mm 요리를 준비합니다. 새 접시에 로딩 솔루션과 장소에서 coverslip을 제거합니다.
6. 이미징 챔버에 coverslip를 탑재합니다. 35mm 요리에서 coverslip을 제거하고 빠르게 세포의 건조를 방지해야하는 챔버에 탑재합니다. 우리는 아래와 샌드위치를​​ 형성 상단에 장착하는 두 번째 coverslip에 장착할 수있는 세포를 포함하는 10mm coverslip을 허용 워너 계측기 제조 이미징 챔버를 사용합니다. 두 coverslips은 챔버를 통해 솔루션의 재관류를 허용 챔버의 양쪽 끝에 진공 챔버에 기름 두 튜브를 확보하고 있습니다. 입력 라인은 주사기에 연결하고 출력 라인은 진공 트랩에 연결된 흡입 라인에 의해납니다 잘 연결되어 있습니다.

현미경

우리는 크세논 아크 램프 (셔터 인 스트 루먼트), 자동 무대 (Ludl), 여기 필터 휠 (Ludl) 및 냉각 비용 - 부부 장치 (CCD) 카메라 (하마 마츠 Orka 갖춘 거꾸로 니콘 이클립스 TE2000 - U 현미경을 사용하여 II). 현미경은 매킨토시 COM에 의해 제어됩니다퓨터 열기 랩 소프트웨어 (순발력)를 실행. 여러 다른 소프트웨어 패키지 ratiometric 이미징 사용할 수 있습니다. 영상을 위해 40, 60 또는 NA가 1.2를 초과와 100x 니콘 플루어 오일 침지 목표를 사용합니다.

이미징 프로토콜

1. 현미경의 무대를 보정합니다.
2. 부하는 공기 거품의 형성을 방지하기 위해 돌보는 입력 라인에 솔루션을 Tyrodes.
3. 챔버에있는 거품의 형성을 방지하기 위해 간병, 다시 한 번 챔버를 통해 재관류 라인과 perfuse의 Tyrodes 솔루션에 챔버를 연결
4. 목적에 기름 한 방울 장소 현미경 단계에 챔버를 배치하고 전달 빛을 사용하여 세포에 중점을두고 있습니다.
5. 340에서와 eyepieces를 사용하여 380 nm의에서 조명을 사용하여 세포의 형광을 검사합니다. 휴식 세포는 380에서 340에 희미 밝은해야합니다. 일반적으로 세포는 10 개 이상 또는 15 초 동안 자외선과 켜지지하지 않아야하며 여기 빛의 강도는 phototoxicity을 방지하기 위해 필터 중립적인 밀도 감소한다.
6. 카메라를 사용하여 세포를 검사하고 잘 340 nm의에서 조명 채도 아래 380 nm의에서 조명 및 채도 (하지만 포화되지 않음)에 가까운 이미지를 생성하는 카메라의 이득과 노출을 설정합니다. 가능하면 200ms 아래의 노출을 유지. 당신은 또한 배경을 변경하지 않는 한 번만 설정할 계획, 카메라 게인이나 노출을 변경하지 마십시오, RMin 및 RMax (아래 참조).
7. 각 파장에서 이미지를 수집하고 각 파장에 대한 이미지에 위치 다양한 배경의 강도를 측정하기 관심 (ROI) 도구의 영역을 사용합니다.
8. 평균 배경 값과 이미징 프로그램의 적절한 위치에 배경 값을 입력합니다. 배경 값이 분야에서 각 픽셀에서 빼는 것입니다.
9. 연습 비율 이미지를 수집하고 오직 세포 아니라 배경과 그 세포의 가장자리에 가까운 지역에 소음되지 않습니다을 포함하는 비율 이미지를 생성하여 각 파장에 대한 경계 값을 조정합니다.
10. 10 % 현장의 모든 세포의 가장 낮은 비율 아래로 최소 비율 값 (RMin)을 설정합니다.
11. 12 회 RMin에 대해되도록 RMax을 설정합니다. 당신이 비교가 어렵게되므로 비교하는 실험 계획 간의 RMin 또는 RMax을 변경하지 마십시오. 우리는 거의 우리의 이미징 장비에 RMin 및 Rmax 값을 변경하지 않습니다.
12. 이 이미지를하려는 필드를 찾기 위해 자동으로 단계를 사용하여 소프트웨어를 사용하여 각 필드의 위치를​​ 기록합니다. 우리는 일반적으로 실험 도중 볼 다섯 분야를 수집합니다. 필드에 자동으로 무대의 움직임은 비율 이미지를 수집하고 다음 필드로 이동합니다.
13. 떨어져 보는 기대되는 신호의 종류에 따라 0.1 10 초 사이에 이미지를 수집하기 위해 시간 경과 간격을 설정합니다.
14. 실험을 시작합니다.
15. 칼슘 이미징 시스템을 테스트를 할 때 그것은 세포내 칼슘 증가와 칼슘을 무료로 세포 솔루션을 일으킬 것입니다 높은 칼륨의 tyrodes (65 MM KCl) 또는 ionomycin (2μM)과 같은 자극을 사용하는 것이 유용입니다 (EGTA 및 BAPTA 같은 칼슘 버퍼를 포함하는 것입니다 ) 그것은 칼슘 농도를 줄일 수 있습니다.

분석

일단 실험은 세포 내의 개별 셀 또는 관심있는 지역에 대한 시간 저속 칼슘 측정에 비율 이미지의 집합을 변환하는 것이 좋습니다 완료됩니다. 이 작업을 수행하려면 :

1. 당신은 칼슘을 측정하고자하는 이미지의 영역을 정의에 관심이 도구 (ROI)의 영역을 사용합니다. 그것은 세포의 세포 시체를 포함 적어도 한 투자 수익 (ROI)을 가지고 일반적으로 유용합니다. 로아을 정의할 때, 그것은 세포 실험의 과정 중에 이동하지 않도록 확인하는 이미지의 동영상을 재생하는 데 유용합니다.
2. 각 이미지의 각 투자 수익 (ROI) 시간 - 저속 비율 측정을 수집하는 소프트웨어를 사용합니다.
3. 분석 프로그램에 비율 측정을 가져옵니다. 당신은 특정 세포 또는 로아, 평균 다중 셀 또는 로아에 대한 칼슘 성분을 확인하고 칼슘 가치를 세포에 대한 비율 측정을 변환해야합니다. 이하 편리도 사용할 수 있지만 우리는, 우리 모두가 이러한 일반적인 분석 작업을하지만, Excel과 같은 다른 프로그램을 수행할 수 있습니다 이고르 프로로 작성된 매크로의 집합을 사용합니다.
4. 방정식 [칼슘] = (RR _분) / (R _최대 - R) SF * KD는 칼슘 농도를 세포에 Fura - 2 비율로 값을 변환하는 데 사용할 수 있습니다. [칼슘] 칼슘 농도는, R은 Fura - 2 380분의 340의 비율이며, RMin 및 RMax는 각각 칼슘의 부재 또는 칼슘의 포화 농도의 존재에 380분의 340 비율되며 그리고 SF * KD입니다 Fura - 2의 KD (RT에서 약 12​​0 nm의)과 스케일링 값의 제품입니다. R _분, R _맥스와 SF * KD을 측정하려면 체외 교정의 생체내 또는에서 중 수행하는 것이 필요합니다. 생체내 교정에 필요한복잡하지만 수있는 패치 클램핑 및 칼슘 이미징의 결합도 매우 정확합니다. 관내 교정에서 교정을 수행하기 위해있는 솔루션의 얇은 레이어를 생성하는 얇은 coverslip 스페이서로 구분이 coverslips 구성된 집에서 만든 교정 챔버를 사용하여 수행할 수 있습니다. 칼슘 농도의 함수로 Fura - 2 비율 값을 측정하는 가장 편리한 방법은 여러 개의 버퍼 칼슘 솔루션 및 Fura - 2 무료 산성을 포함 교정 키트를 사용하는 것입니다. 이들은 Invitrogen (분자 프로브)에서 얻은 및 사용에 대한 정확한 지침을 포함할 수 있습니다.

이 프레 젠 테이션에서 우리는 AM Fura - 2를 사용하여 칼슘 이미징을 수행하는 모든 단계를 통과했습니다. 우리는 모델로 대뇌 피질의 뉴런을 사용하지만, 칼슘 이미징은 세포의 다양한 실시간으로 세포 내 칼슘을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 플라스틱 종종 영상이 어려운하게 자외선 파장에서 형광 있기 때문에, 대신에 플라스틱 유리 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 또한, polyornithine 및 laminin과 coverslips 분리로부터 세포를 방지하기 위해 사전에 코팅하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 이미징 챔버를 통해 솔루션을 perfusing 때 공기 방울을 만드는 피하기 위해 기억하는 것이 중요합니다.