The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Brain Research Institute, Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Department of Neurology, University of California, Los Angeles
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Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071, doi:10.3791/1071 (2009).
1. पेप्टाइड तैयारी
2. HFIP इलाज पेप्टाइड्स Solubilizing और फोटो पार से जोड़ने
3. एसडीएस पृष्ठ और ज़ुल्फ़ धुंधला हो जानापार से जुड़े पेप्टाइड उत्पादों की
भाग 4: प्रतिनिधि के परिणाम (चित्रा 1)
चित्रा 1: चांदी से सना हुआ polyacrylamide uncross से जुड़े दिखा जैल (-) और फोटो पार से जुड़े (+) GRF, कैल्सीटोनिन, Aβ40, और Aβ42
एसडीएस पृष्ठ और पीआईसीयूपी उत्पन्न Aβ40 oligomers की चांदी धुंधला विश्लेषण monomer के लगभग इसी तरह tetramer के माध्यम से बैंड तीव्रता, उच्च 7 oligomers का बहुतायत में तेज कमी के द्वारा बाद दिखा. Uncross से जुड़े Aβ40 7 monomer के साथ एक संगत श्री के साथ migrates . Aβ42 एक अलग oligomer आकार के वितरण से पता चलता है. Aβ42 oligomers 2-3 8 समूहों में शामिल हैं. पहले समूह, trimer माध्यम monomer, बढ़ती oligomer आदेश के साथ तीव्रता को कम प्रदर्शित करता है. दूसरे समूह में, एक गाऊसी - तरह वितरण tetramer और heptamer के बीच मनाया जाता है पर pentamer है और hexamer एक अधिकतम के साथ. तीसरे समूह है, जो यहाँ नहीं दिखाया गया है श्री ~ 30,000-60,000 8 दा की oligomers शामिल हैं . इन उच्च श्री oligomers आमतौर पर एसईसी - पृथक Aβ42 LMW का उपयोग करने के लिए मनाया जाता है, लेकिन नहीं पेप्टाइड निस्पंदन या HFIP 6 उपचार द्वारा तैयार. Aβ42 Uncross से जुड़े मुख्य रूप से दो बैंड, एक monomer के बैंड और एक व्यापक बैंड / trimer tetramer, जो एक 5,9 एसडीएस द्वारा प्रेरित मूर्ति है पैदा करता है. कैल्सीटोनिन पैदावार एक oligomer आकार वितरण है कि जोरदार tetramer के माध्यम से क्षेत्र monomer में एक नीरस घातीय कमी से diverges, dimers, trimers, और 7 tetramers के पूर्व अस्तित्व का सुझाव दे. नियंत्रण पॉलीपेप्टाइड, GRF, एक monotonic oligomer ऐसी है कि oligomers का स्पष्ट रिश्तेदार मात्रा बढ़ती आणविक जन के साथ तेजी से कमी hexamer के माध्यम से डिमर से लेकर वितरण पैदा करता है. अन्य प्रयोगों में, उच्च oligomers भी 7 visualized किया जा सकता है . सही संख्या और oligomer बैंड के रिश्तेदार तीव्रता कुछ वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता, प्रोटीन की मात्रा जेल पर लोड, और चांदी धुंधला प्रोटोकॉल में विकास के कदम के लिए प्रयोग किया जाता समय पर निर्भर करता है प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
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पीआईसीयूपी मूल स्थिर प्रोटीन परिसरों 2 अध्ययन के लिए विकसित किया गया था. विधि metastable amyloid प्रोटीन सहित 10 Aβ, और रोग संबद्ध prion PRP 11 एससी, और α-synuclein 12 विधानसभाओं, मात्रात्मक अध्ययन के बाद लागू किया गया था. सबसे महत्वपूर्ण कारक है कि जब एक पीआईसीयूपी प्रयोग डिजाइनिंग विचार किया जाना चाहिए अभिकर्मक stoichiometry, विकिरण समय और नमूना तैयार करने की प्रक्रिया कर रहे हैं. पूर्व दो मुद्दों अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जबकि बाद मुद्दा काफी हद तक प्रयोगात्मक डेटा की व्याख्या को प्रभावित करता है हो सकता है. विशेष रूप से amyloidogenic प्रोटीन के लिए, metastable oligomers के आकार के वितरण का निर्धारण कुल मुक्त शुरू करने की तैयारी का उपयोग कर की आवश्यकता है. पृष्ठभूमि, तंत्र, इंस्ट्रूमेंटेशन, प्रोटोकॉल, अनुकूलन, गुंजाइश, संशोधनों, अनुप्रयोगों, और पीआईसीयूपी की सीमाओं पिछले 1,2,13 प्रकाशनों में शामिल थे. पीआईसीयूपी स्थिर, घुलनशील प्रोटीन oligomers उत्पन्न कि निम्नलिखित fractionation और शुद्धि, संरचनात्मक अध्ययन, cytotoxicity assays, oligomerization निषेध अध्ययन, और आणविक मान्यता टूल्स के विकास के लिए लक्ष्य के रूप में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है.
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यह काम AG027818 अनुदान और लैरी एल Hillblom फाउंडेशन, IIRG-07-58,334 अल्जाइमर एसोसिएशन से, और सार्वजनिक स्वास्थ्य के कैलिफोर्निया विभाग से 07-65798 से AG030709 NIH / एनआईए, 2005/2E से के द्वारा समर्थित किया गया.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
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ReplyPosted by: deepa k.June 2, 2010, 8:32 AM