תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

1. פפטיד הכנה

1. לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי.
2. כאן, אנו משתמשים פפטידים מראש שטופלו 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי להשיג הומוגניות, במצטבר ללא הכנות. צעד זה הוא הכרחי משום מראש יצרו אגרגטים לגרום להצטברות מהירה של חלבונים amyloidogenic, אשר התוצאה reproducibility העניים בקרב ניסויים ^5. שיטות אחרות כגון סינון ה-SEC גם יכול לשמש כדי להשיג המצרפי ללא ההכנות PICUP ^6.
3. כדי לטפל פפטידים עם HFIP, טרום הקור מיכל HFIP על הקרח בתוך ברדס קטר לבוש הגנה נאותה (HFIP הוא נדיפים רעילים). קירור של בקבוק 250 מ"ל מחייב בדרך כלל 10-15 דקות. הוסף HFIP מראש צונן צינורות המכיל lyophilizates פפטיד לקבל ריכוז הפפטיד נומינלית של 0.5 מ"מ.
4. Sonicate הפתרונות פפטיד sonicator מים באמבט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. וורטקס בעדינות דגירה צינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
6. צ'יל הצינורות על הקרח (דקות 1), ולחלק את פתרונות ל 10-50-μl aliquots שכותרתו ב 0.6-מ"ל נמוך צינורות בעלי כושר ספיגה.
7. הסר HFIP על ידי אידוי תחת זרם עדין של חנקן, או לעזוב את צינורות פתוחים בשכונה קטר בן לילה. עבור אידוי לילה, במקום צינורות פתוחים במעמד ומכסים אותם עם סדין גדול של Kimwipes כדי למנוע אבק וזיהום החלקיקים.
8. Exsiccate HFIP הנותרים האור בריק ב lyophilizer, או concentrator צנטריפוגלי למשך 30 דקות, או exsiccator מצורף כניסת ואקום עבור 2 ח המוצר הסופי יהיה סרט פפטיד בתחתית הצינורות microfuge. אם exsiccated כראוי, צינורות יכול להיות מאוחסן אטום ב -20 או -80 ° C. במשך תקופות ממושכות (חודשים)

2. Solubilizing HFIP שטופלו פפטידים צילום cross-linking

1. לפני solubilizing HFIP שטופלו פפטידים עבור cross-linking תגובות, צריך להכין את cross-linking ו ריאגנטים מרווה.
2. לשקול את persulfate אמוניום (APS, מר 228.2 g / mol) ולהכין פתרון 20 מ"מ פוספט 10 mM נתרן, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור.
3. הכן פתרון 1 מ"מ טריס (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy, מר 748.63 g / mol) ב 10 mM נתרן פוספט, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת לאמת התפרקות מוחלטת. הגן על הצינור מן האור באמצעות רדיד אלומיניום.
4. לניתוח SDS-PAGE הבאים cross-linking, מגיב מרווה נוח היא 5% β-mercaptoethanol ב 2 × SDS-PAGE חיץ המדגם. לחלופין, 1 M dithiothreitol (DTT, מר 154.5 g / mol) במים deionized או חיץ מתאים יכול לשמש.
5. HFIP שטופלו סרטים פפטיד הם מומסים לדלל NaOH הראשון ולאחר מכן פוספט נתרן חיץ נוסף כדי לקבל ריכוז הפפטיד ~ 30 מיקרומטר. הוסף 60 mM NaOH ואחריו deionized המים לתוך הצינור המכיל את הסרט פפטיד כזה NaOH מים מהווים 10 ו - 45% מנפח הסופי, בהתאמה. גרדו את הסרט פפטיד מהקירות בתוך צינור microfuge משתמש קצה, על ידי שילוב pipetting למעלה ולמטה, ועל sonicate במשך 5 דקות בתוך sonicator מים באמבטיה.
6. הוסף 45% 20 mM נתרן פוספט, pH 7.4, לערבב ידי pipetting ו צנטריפוגות ב g 16,000 עבור 10 דקות. מניחים בצד aliquots של uncross צמודות פפטידים מעורבב עם מגיב מרווה עבור פקדי שלילית.
7. כוון את המצלמה תריס, עיכוב 1 s. בזמנים קרינה גבוהות יותר, התגובות רדיקלי נרחב עלול לגרום פירוק חלבונים. טען את תריס המצלמה. זמן הקרנה ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה כאשר בשיטת עם חלבון חדש.
8. תגובה PICUP טיפוסי מבוצע בהיקף 20 תגובה μl. העברת 18 μl של הפתרון הפפטיד לתוך צינורית דקה חומה, ברור, PCR 0.2-מ"ל.
9. לפתרון פפטיד, להוסיף 1 RuBpy μl ואחריו APS 1 μl ומערבבים ריאגנטים ידי pipetting (הריכוז הסופי של RuBpy ו APS בתערובת התגובה תהיה 0.05 ו - 1 מ"מ, בהתאמה).
10. במהירות למקום צינור תגובה בתוך בקבוקון 1.8 מ"ל זכוכית. מניחים את הבקבוקון בתוך מפוח מצורף מול גוף המצלמה. צרף את מגן העדשה ולחץ על תריס כך המדגם הוא מוקרן עבור 1 s בתוך המפוח.
11. לאחר הקרנת המדגם, מהר לקחת את הבקבוקון מן המפוח ואת הצינור PCR מתוך הבקבוקון. במהירות להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 או 10 μl DTT מדגם μl צמצום מאגר הדפים. חזור על התגובה aliquot כל פפטיד.
12. תערובות התגובה כעת ניתן קפוא ב -20 ° C עבור אחסון לא יותר מ 7 ימים או שמרו על הקרח לפני הניתוח על ידי-SDS וכסף-מכתים.

3. SDS-PAGE ו רסיס-מכתיםשל צולבים מוצרים פפטיד

1. שגרה SDS-PAGE ו כסף מכתים מבוצעות לדמיין צולבים פפטידים.
2. טען 5 μl מתערובת התגובה לכל נתיב להשיג ~ 130 pmol של הפפטיד לכל נתיב.
3. כלול כמויות דומות של uncross צמודות פפטידים להשוואה. כמו כן כוללים סולם חלבון סטנדרטי עבור אומדן ויזואלי של משקל מולקולרי של להקות פפטיד.
4. הרץ את הג'ל באמצעות מנגנון סטנדרטי ג'ל אלקטרופורזה. אנו משתמשים SureLock XCell Mini-Cell המערכת Invitrogen ולבצע כסף מכתים לפי Invitrogen פרסום IM-1002, Novex טרום יצוקה ג'ל אלקטרופורזה מדריך.

חלק 4: תוצאות נציג (איור 1)

איור 1: כסף מוכתם ג'לים polyacrylamide מראה uncross צמוד (-) ו צילום צולבים (+) פוי, קלציטונין, Aβ40 ו Aβ42

SDS-PAGE ו כסף מכתים ניתוח PICUP שנוצר Aβ40 oligomers להראות בעוצמות הלהקה דומה של כ מונומר דרך tetramer, ואחריו לירידה חדה שפע oligomers גבוה ^7. Uncross צמודות Aβ40 נודד עם מר בקנה אחד עם זה של מונומר ^7. Aβ42 מראה חלוקה ברורה גודל oligomer. Aβ42 oligomers מהווים 2-3 קבוצות ^8. הקבוצה הראשונה, מונומר דרך trimer, מציג ירידה באינטנסיביות עם סדר oligomer גוברת. בקבוצה השנייה, הפצה גאוס כמו שנצפה בין tetramer ו heptamer, עם מקסימום ב pentamer ו hexamer. הקבוצה השלישית, אשר אינו מוצג כאן, מכיל oligomers של מר ~ 30,000-60,000 דה ^8. Oligomers אלה גבוהה בדרך כלל מר הם נצפו באמצעות ה-SEC, מבודדות LMW Aβ42 אך לא פפטיד שהוכן על ידי סינון או טיפול HFIP ^6. Uncross צמודות Aβ42 מייצרת בעיקר שתי להקות, להקה מונומר ותזמורת רחב trimer / tetramer, המהווה artefact המושרה על ידי SDS ^5,9. קלציטונין התשואות גודל oligomer הפצה חזק סוטה מירידה מעריכי מונוטוני ב מונומר את האזור באמצעות tetramer, מה שמרמז מראש קיומה של הדימרים, trimers, ו tetramers ^7. השליטה פוליפפטיד, פוי, מייצר הפצה oligomer מונוטונית החל dimer דרך hexamer כזה כמויות יחסית לכאורה של oligomers ירידה אקספוננציאלית עם הגדלת המסה המולקולרית. בניסויים אחרים, oligomers גבוה גם יכול להיות ⁷ דמיינו. המספר המדויק ואת עוצמות היחסי של להקות oligomer עשוי להשתנות מעט בין ניסויים תלוי בריכוז החלבון בפועל, את כמות החלבון טעון על הג'ל, והזמן המשמש בשלב פיתוח פרוטוקול כסף מכתים.

PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב ^2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל ¹⁰ Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP ^{Sc 11,} ו - α-synuclein ^12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה, והכנת הליך הדגימה. לשעבר שני נושאים עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי, ואילו הנושא השני משפיע בעיקר פרשנות של נתונים ניסיוניים. עבור חלבונים amyloidogenic בפרט, קביעה של הפצות גודל oligomers metastable מחייבת שימוש המצרפי ללא הכנות ההתחלה. ברקע, מנגנון, מכשור פרוטוקול, אופטימיזציה, היקף, שינויים, יישומים, ואת המגבלות של PICUP היו מכוסות בפרסומים קודמים ^1,2,13. PICUP יכול לשמש כדי ליצור יציבות, oligomers חלבון מסיס כי חלוקה טיהור הבאים, יוכל לשמש מחקרים מבניים, מבחני cytotoxicity, oligomerization-עיכוב מחקרים, וכן מטרות התפתחות ההכרה המולקולרית כלים.