Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas

1. Preparação de peptídeos

1. Pesar ~ 100-200 mg de peptídeo liofilizado usando uma microbalança e transferência para rotulados, revestido a silicone, tubos de microcentrífuga de baixa adsorvente. Aqui, nós usamos seqüências de humanos de Aβ40, Aβ42, calcitonina e GRF.
2. Aqui, usamos peptídeos pré-tratados com 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obter homogênea, agregar-free preparativos. Esta etapa é necessária porque pré-formados agregados induzir a agregação rápida de proteínas amiloidogênicas, que resultam em reprodutibilidade pobres entre os experimentos ^5. Outros métodos, como a filtração ea SEC também pode ser usado para obter agregados sem preparativos para picup ^6.
3. Para tratar os peptídeos com HFIP, pré-resfriar o recipiente com gelo dentro HFIP um exaustor usando proteção adequada (HFIP é volátil e tóxico). Resfriamento de uma garrafa de 250 ml normalmente exige 10-15 min. Adicionar HFIP de pré-refrigerados contendo tubos lyophilizates peptídeo para obter uma concentração de peptídeo nominal de 0,5 mM.
4. Sonicate as soluções em um peptídeo sonicador banho-maria por 5 minutos em temperatura ambiente.
5. Vortex suavemente e incubar os tubos durante 30 min à temperatura ambiente.
6. Relaxar os tubos no gelo (para 1 min), e dividir as soluções em 10-50-mL em alíquotas de 0,6 ml rotulados de baixa adsorvente tubos.
7. Remover HFIP por evaporação sob uma ligeira corrente de nitrogênio, ou deixar os tubos abertos na capela durante a noite. Para a evaporação durante a noite, coloque os tubos abertos em um rack e cobri-los com uma grande folha de Kimwipes para evitar poeira e contaminação por partículas.
8. Enxugar o HFIP restantes no vácuo em um liofilizador, ou um concentrador de centrífuga por 30 min, ou em um exsiccator ligado a uma entrada de vácuo por 2 h. O produto final será um filme peptídeo na parte inferior dos tubos de microcentrífuga. Se devidamente ressecada, os tubos podem ser armazenados por longos períodos hermético (meses) a -20 ou -80 ° C.

2. Solubilizar os peptídeos HFIP-tratados e foto cross-linking

1. Antes de solubilizar os peptídeos HFIP-tratado para cross-linking reações, é preciso preparar o cross-linking e reagentes de extinção.
2. Pesar persulfato de amônio (APS, o Sr. 228,2 g / mol) e preparar uma solução de 20 mm em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex até que a solução é clara.
3. Prepare uma solução mM de Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium hexa (II) (RuBpy, deputado 748,63 g / mol) em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex e verificar a completa dissolução. Proteger o tubo de luz usando uma folha de alumínio.
4. Para SDS-PAGE após análise cross-linking, um reagente quenching conveniente é de 5% β-mercaptoetanol em 2 × SDS-PAGE tampão de amostra. Alternativamente, um M ditiotreitol (DTT, o Sr. 154,5 g / mol) em água deionizada ou um tampão adequado pode ser usado.
5. Filmes HFIP tratados com peptídeo são dissolvidos em NaOH diluída primeiro e depois tampão fosfato de sódio é adicionado para obter concentração de peptídeo ~ 30 mM. Adicionar 60 mM NaOH seguido de água deionizada no tubo contendo o filme de tal forma que peptídeo NaOH e água constituem 10 e 45% do volume final, respectivamente. Raspe o filme peptídeo fora das paredes dentro do tubo de microcentrífuga, utilizando a ponta, misture pipetando cima e para baixo, e sonicate por 5 minutos em um sonicador banho-maria.
6. Adicionar 45% de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, mix de pipetagem, e centrifugar a 16.000 g por 10 min. Separe alíquotas de descruzar-linked peptídeos misturado com o reagente de têmpera para controles negativos.
7. Ajustar a câmera do obturador demora a 1 s. Às vezes maior irradiação, extensas reações radicais podem causar degradação de proteínas. Carregar o obturador da câmera. Tempo de irradiação pode precisar de ser otimizado quando se utiliza o método com uma nova proteína.
8. Uma reação típica é picup realizada em um volume de reação 20 l. Transferência de 18 mL da solução de peptídeo em uma parede fina, clara, tubo de PCR de 0,2 ml.
9. Para a solução de peptídeo, adicione 1 mL RuBpy seguido por uma APS mL e misturar os reagentes por pipetagem (a concentração final de RuBpy APS e na mistura de reação será 0,05 e 1 mM, respectivamente).
10. Colocar rapidamente o tubo de reação dentro de um frasco de vidro de 1,8 mL. Coloque o frasco dentro do fole anexado na frente do corpo da câmera. Anexar o protetor de lente e pressione o botão do obturador para que a amostra é irradiada por 1 s no interior do fole.
11. Após a irradiação da amostra, assumir rapidamente o frasco fora do fole e do tubo de PCR fora do frasco. Rapidamente saciar a reação pela adição de um TDT mL ou 10 mL tampão de amostra reduzindo PAGE. Repita a reação para cada alíquota peptídeo.
12. As misturas de reação pode agora ser congeladas a -20 ° C para o armazenamento por um período de 7 dias ou mantidos em gelo antes da análise por SDS-PAGE e coloração de prata.

3. SDS-PAGE e tira-manchasde produtos cross-linked peptídeo

1. Rotina SDS-PAGE e coloração prata-são realizadas para visualizar cruzada peptídeos.
2. Carga de 5 mL da mistura de reação por pista para obter ~ 130 pmol de peptídeo por pista.
3. Incluem quantidades similares de descruzar-linked peptídeos para comparação. Também incluem uma escada de proteína padrão de aproximação visual de bandas de peso molecular de peptídeos.
4. Executar o gel utilizando um aparelho de eletroforese em gel padrão. Nós usamos o sistema de XCell SureLock Mini-Cell da Invitrogen e realizar a coloração de prata de acordo com a publicação Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Guia de eletroforese em gel.

Parte 4: Resultados Representante (Figura 1)

Figura 1: géis de poliacrilamida mostrando uncross-linked (-) e foto-cross-linked (+) GRF, calcitonina, Aβ40 e Aβ42

SDS-PAGE e coloração prata-análises de picup gerado Aβ40 oligômeros mostram intensidades banda aproximadamente igual de monômero através tetrâmero, seguido por uma acentuada diminuição na abundância de oligômeros maior ^7. Descruze-linked Aβ40 migra com um deputado consistente com a de monômero ^7. Aβ42 mostra uma distribuição de tamanho distintas oligômero. Aβ42 compreendem oligômeros 2-3 grupos de ^8. O primeiro grupo, através de monômero trímero, exibe a diminuir de intensidade com a ordem crescente de oligômero. No segundo grupo, a distribuição de Gauss-como é observada entre tetrâmero e heptamer, com um máximo em pentâmero e hexâmero. O terceiro grupo, que não é mostrado aqui, contém oligômeros do Sr. ~ 30,000-60,000 Da ^8. Estes oligômeros maior Mr normalmente são observados usando SEC isolada LMW Aβ42 mas não peptídeo preparada por filtração ou tratamento HFIP ^6. Descruze-linked Aβ42 produz predominantemente duas bandas, uma banda de monômero e uma banda trímero / tetrâmero amplo, que é um artefato induzida por SDS ^5,9. Calcitonina produz uma distribuição de tamanho de oligômero que diverge fortemente de uma diminuição monótono exponencial do monômero região através tetrâmero, sugerindo pré-existência de dímeros, trímeros, tetrâmeros e ^7. O controle de polipeptídeo, GRF, produz uma distribuição de oligômero monotônica desde dímeros através de hexâmero de tal forma que os montantes aparente relativa de oligômeros diminuir exponencialmente com o aumento da massa molecular. Em outros experimentos, oligômeros mais altas também poderiam ser visualizadas ^7. O número exato e intensidades relativas das bandas de oligômero pode variar um pouco entre os experimentos, dependendo da concentração de proteína real, a quantidade de proteína carregado no gel, eo tempo utilizado para a etapa de desenvolvimento no protocolo de coloração prateada.

Picup foi desenvolvido originalmente para estudar complexos de proteína estável ^2. O método foi aplicado mais tarde para estudo quantitativo de assembléias amilóide metaestável proteína, incluindo Aâ ^10, prion e doenças associadas ao PrP ^{Sc 11,} e α-sinucleína ^12. Os fatores mais importantes que devem ser considerados ao projetar um experimento picup estão a estequiometria reagente, tempo de irradiação, eo procedimento de preparação da amostra. As duas primeiras questões podem exigir otimização empírica, enquanto que a última questão em grande parte afeta a interpretação dos dados experimentais. Para proteínas amiloidogênicas em particular, a determinação de distribuições de tamanho de oligômeros metaestável requer o uso de agregado sem preparativos de partida. O pano de fundo, o mecanismo, instrumentação, protocolo, otimização, escopo, modificações, aplicações e limitações do picup foram cobertos em publicações anteriores ^1,2,13. Picup pode ser usado para gerar estável, oligômeros proteína solúvel que seguir fracionamento e purificação, poderiam ser usados ​​para estudos estruturais, ensaios de citotoxicidade, oligomerização inibição de estudos, e como alvos para o desenvolvimento de reconhecimento molecular ferramentas.