Photo-Induced Cross-Linking delle proteine ​​non modificati (PICUP) applicata a peptidi amiloidogenico

1. Peptide preparazione

1. Pesare ~ 100-200 mg di peptide liofilizzato utilizzando una microbilancia e trasferimento in etichetta, siliconato, a basso adsorbente tubi microcentrifuga. Qui, usiamo le sequenze umano di Aβ40, Aβ42, calcitonina, e GRF.
2. Qui, usiamo peptidi pre-trattati con 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) per ottenere omogeneo, aggregato senza preparazioni. Questo passaggio è necessario perché preformato aggregati indurre una rapida aggregazione di proteine ​​amiloidogenica, che si traducono in scarsa riproducibilità tra esperimenti ^5. Altri metodi, quali il filtraggio e la SEC può anche essere utilizzato per ottenere aggregati privi preparativi per PICUP ^6.
3. Per trattare i peptidi con HFIP, pre-chill contenitore HFIP sul ghiaccio all'interno di una cappa aspirante indossando una protezione adeguata (HFIP è volatile e tossico). Raffreddamento di una bottiglia da 250 ml in genere richiede 10-15 minuti. Aggiungi HFIP di pre-raffreddata provette contenenti lyophilizates peptide per ottenere una concentrazione nominale peptide di 0,5 mm.
4. Sonicare le soluzioni peptide in un bagnomaria ultrasuoni per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Vortex delicatamente e incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Freddo i tubi in ghiaccio (per 1 min), e dividere le soluzioni in 10-50-microlitri aliquote in etichetta 0,6 ml basso adsorbente tubi.
7. Rimuovere HFIP per evaporazione sotto leggera corrente di azoto, o lasciare i tubi aperti nella cappa durante la notte. Per evaporazione durante la notte, il luogo tubi aperti in un rack e coprire con un grande foglio di Kimwipes per evitare che polvere e contaminazioni particolato.
8. Essiccare il HFIP rimanenti nel vuoto in un liofilizzatore, o un concentratore centrifugo per 30 minuti, o in un exsiccator collegato a un ingresso vuoto per 2 ore Il prodotto finale sarà un film peptide sul fondo dei tubi microcentrifuga. Se opportunamente essiccate, i tubi possono essere conservati a tenuta d'aria per lunghi periodi (mesi) a -20 e -80 ° C.

2. Solubilizzante il HFIP trattati con peptidi e foto di cross-linking

1. Prima solubilizzante il HFIP trattati con peptidi per il cross-linking reazioni, bisogna preparare il cross-linking e reagenti di raffreddamento.
2. Pesare persolfato di ammonio (APS, il signor 228,2 g / mol) e preparare una soluzione di 20 mM a 10 mM fosfato di sodio, pH 7.4. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
3. Preparare soluzione 1 mM di Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) esaidrato (RuBpy, il signor 748,63 g / mol) in 10 mM fosfato di sodio, pH 7.4. Mescolare con un vortice e verificare la completa dissoluzione. Proteggere il tubo dalla luce con un foglio di alluminio.
4. Per SDS-PAGE seguente analisi cross-linking, un reagente tempra conveniente è del 5% β-mercaptoetanolo in 2 × SDS-PAGE tampone del campione. In alternativa, 1 M ditiotreitolo (DTT, il signor 154,5 g / mol) in acqua deionizzata o un buffer adatto può essere usato.
5. HFIP trattati con film peptide sono sciolti in NaOH diluito e poi tampone fosfato di sodio viene aggiunto per ottenere la concentrazione del peptide ~ 30 micron. Aggiungere 60 mM NaOH seguito da acqua deionizzata nella provetta contenente il film peptide tale che NaOH e acqua costituiscono il 10 e il 45% del volume finale, rispettivamente. Raschiare il film peptide fuori le pareti interne della provetta da microcentrifuga usando la punta, mescolare pipettando su e giù, e ultrasuoni per 5 minuti in un bagnomaria ultrasuoni.
6. Aggiungere il 45% di fosfato di sodio 20 mM, pH 7,4, mescolare pipettando, e centrifugare a 16.000 g per 10 min. Mettere da parte aliquote di disincrociare legata peptidi miscelato con il reagente di spegnimento per i controlli negativi.
7. Regolare l'otturatore della fotocamera di ritardo a 1 s. A volte l'irradiazione superiore, ampia reazioni radicale può causare la degradazione delle proteine. Caricare l'otturatore della fotocamera. Tempo di irradiazione aver bisogno di essere ottimizzato quando si utilizza il metodo con una nuova proteina.
8. Una reazione tipica PICUP viene eseguita in un volume di reazione di 20 microlitri. Trasferire 18 microlitri della soluzione del peptide in una parete sottile, trasparente, 0,2 ml di tubo di PCR.
9. Per la soluzione di peptide, aggiungere 1 RuBpy microlitri seguito da 1 APS microlitri e mescolare i reagenti pipettando (la concentrazione finale di RuBpy e APS nella miscela di reazione sarà 0,05 e 1 mm, rispettivamente).
10. Rapidamente mettere il tubo di reazione all'interno di un 1,8 mL flaconcino di vetro. Mettere il flaconcino all'interno del soffietto attaccato davanti al corpo della fotocamera. Fissare la protezione dell'obiettivo e premere il pulsante di scatto in modo che il campione è irradiato per 1 s all'interno del soffietto.
11. Dopo l'irradiazione del campione, assumere rapidamente il flacone dal soffietto e il tubo di PCR dal flaconcino. Rapidamente placare la reazione aggiungendo 1 DTT microlitri o 10 microlitri di buffer riducendo campione PAGINA. Ripetere la reazione per ciascuna aliquota peptide.
12. Le miscele di reazione può essere congelato a -20 ° C per lo stoccaggio per non più di 7 giorni o tenuta in ghiaccio prima dell'analisi mediante SDS-PAGE e colorazione argento.

3. SDS-PAGE e colorazione scheggia-di cross-linked peptide

1. Routine SDS-PAGE e colorazione argento vengono eseguite per visualizzare reticolato peptidi.
2. Di carico 5 microlitri della miscela di reazione per corsia di ottenere ~ 130 pmol di peptide per corsia.
3. Includi quantità simili di disincrociare legati peptidi per il confronto. Includono anche una scaletta standard di proteine ​​per approssimazione visiva di peso molecolare di bande peptide.
4. Esegui il gel con uno standard apparato elettroforesi su gel. Usiamo il XCell SureLock Mini-Cell sistema da Invitrogen ed eseguire argento colorazione secondo Invitrogen pubblicazione IM-1002, Novex Pre-Cast Guida elettroforesi su gel.

Parte 4: Risultati Rappresentante (Figura 1)

Figura 1: Argento macchiato di gel di poliacrilammide mostrando disincrociare-linked (-) e foto-cross-linked (+) GRF, calcitonina, Aβ40 e Aβ42

SDS-PAGE e colorazione argento-analisi di PICUP generati Aβ40 oligomeri mostrano intensità di banda di circa simili di monomero attraverso tetramero, seguita da un forte calo l'abbondanza di una maggiore oligomeri ^7. Sciogliete legata Aβ40 migra con un coerente con quello del monomero ^{7 Il} sig. Aβ42 mostra un distinto distribuzione delle dimensioni oligomeri. Aβ42 oligomeri comprendono 2-3 gruppi di ^8. Il primo gruppo, monomero attraverso trimero, decrescenti intensità con oligomeri ordine crescente. Nel secondo gruppo, una distribuzione gaussiana, come si osserva tra tetramero e heptamer, con un massimo a pentamero e esamero. Il terzo gruppo, che non è qui, contiene oligomeri del sig ~ 30,000-60,000 Da ^8. Questi oligomeri superiori Sig. tipicamente vengono osservate con SEC-isolato LMW Aβ42 ma non peptide preparato per filtrazione o trattamento HFIP ^6. Sciogliete-linked Aβ42 produce prevalentemente due bande, una band monomero e un ampio trimero / tetramero band, che è un artefatto indotto da ^5,9 SDS. Calcitonina produce una distribuzione delle dimensioni oligomero che si discosta fortemente da una diminuzione monotona esponenziale nel monomero regione attraverso tetramero, suggerendo pre-esistenza di dimeri, trimeri e tetrameri ^7. Il controllo polipeptide, GRF, produce una distribuzione monotona oligomero che vanno dal dimero attraverso esamero tale che gli importi relativi apparente di oligomeri diminuiscono in modo esponenziale con l'aumentare della massa molecolare. In altri esperimenti, una maggiore oligomeri potrebbe anche essere visualizzati ^7. Il numero esatto e le intensità relative delle bande oligomeri possono variare un po 'tra gli esperimenti a seconda della concentrazione di proteine ​​reali, la quantità di proteina caricata sul gel, e il tempo utilizzato per la fase di sviluppo nel protocollo di colorazione argento.

PICUP è stato sviluppato originariamente per studiare complessi proteici stabili ^2. Il metodo è stato applicato in seguito allo studio quantitativo delle assemblee metastabili proteina amiloide, tra cui Aβ ^10, prioni e le malattie associate PrP ^{Sc 11} e α-sinucleina ^12. I fattori più importanti che devono essere considerati quando si progetta un esperimento PICUP sono la stechiometria dei reagenti, tempo di irradiazione, e la preparazione procedura di esempio. I primi due problemi può richiedere l'ottimizzazione empirica, considerando che la questione riguarda in gran parte quest'ultima interpretazione dei dati sperimentali. Per le proteine ​​amiloidogenica in particolare, la determinazione della distribuzione delle dimensioni di oligomeri metastabili richiede l'uso di preparati a partire aggregato-free. Lo sfondo, meccanismo, strumentazione, protocollo, l'ottimizzazione, la portata, le modifiche, le applicazioni e le limitazioni di PICUP sono stati coperti in precedenti pubblicazioni ^1,2,13. PICUP può essere utilizzato per generare stabile, oligomeri proteina solubile che a seguito di frazionamento e purificazione, potrebbe essere utilizzato per studi strutturali, test di citotossicità, oligomerizzazione inibizione studi, e come bersagli per lo sviluppo di strumenti di riconoscimento molecolare.