Hoge-resolutie video-Tracking van Locomotion in Adult Drosophila melanogaster

Deel 1: voeding en management van vliegen

1. Vliegen moeten worden gekweekt in flesjes met gist-vrije standaard media. U moet een groot aantal vliegen, zodat kruisingen moeten worden opgezet. Vliegen moeten worden gekweekt in een 12-uur licht: donker cyclus bij 25 º C.
2. Vliegen worden verzameld kort na Eclosion (1-3 dagen). Vliegen kan worden gewerkt met op dit moment met behulp van een diffuser kooldioxide, en dient te worden gesorteerd in reageerbuizen met geautoclaveerd of gist-vrije media. Wij gebruiken alleen voor mannen, opgeslagen 10 in een reageerbuis.
3. Laat minstens een dag of twee na het gebruik van koolstofdioxide voor het uitvoeren van de gedragsexperimenten. We lopen vliegen in ons gedrag test 3-5 dagen na Eclosion.
4. Testen moeten altijd worden gedaan binnen dezelfde 2-3 uur tijd venster elke dag circadiaan ritme problemen te voorkomen.

Deel 2: Het opzetten van de tracking-systeem in een gecontroleerde omgeving

1. Alle experimenten worden uitgevoerd in een omgeving ruimte die een constante temperatuur van 25 º C met 70% vochtigheid behoudt.
2. Opschorten van een digitale video camera over het gebied dat moet worden opgenomen (camera naar beneden). Aangezien onze tracking software wordt het contrast-gebaseerd, we schorten de camera over een lichtbak. De camera registreert video's direct op een Dell-computer via een firewire aansluiting. We maken gebruik van een Sharp digitale videocamera, aangesloten op een Dell computer met Windows Moviemaker (Vista versie) voor video-acquisitie.
3. Lucht pulsen zal worden toegediend in dit protocol, dus een bron voor de luchtstroom moet aanwezig zijn in de kamer. Met behulp van rubberen slangen, sluit de lucht bron naar een koolstof filter voor luchtfiltering.
4. Het gebruik van meer rubber slang, sluit u de andere kant van de koolstof filter om een ​​erlenmeyer via een holle rubber stop, en vul de kolf met ongeveer een halve centimeter van het water. Dit zal bevochtigen de lucht.
5. De kolf moet ook een pistool, dat contact maakt met een Y-vormige klep via de rubber slang.
6. Een tak van de Y-klep moet worden aangesloten op een flowmeter. De andere tak moet leiden tot de lucht naar het plein voortbeweging kamer.

Deel 3: Het leveren vliegt naar de voortbeweging kamer

1. Het plein voortbeweging kamer is gebaseerd op het ontwerp van Wolf et al.. 2002 ^1, met de toevoeging van kleine druppel laden om de vliegen te voorkomen dat vliegen in de kamer. De kamer moet uit elkaar worden genomen, en alle componenten moeten grondig worden afgeveegd neer met 70% ethanol en gedroogd voor gebruik.
2. Anesthesie direct voor het uitvoeren van een gedrags-test kan mogelijk compromis prestaties. Om dit te voorkomen, zijn vliegen zachtjes klopte in de kamer met behulp van een trechter met een klein stopcontact. Om een ​​uitlaat van de juiste grootte, voeg een blauwe pipet tip (voor de P1000) aan het einde van een trechter. Gebruik een schaar af te snijden aan het einde van de pipetpunt om de opening groot genoeg voor een vlieg te passeren.
3. De top van onze kamer is een klein stukje van plexiglas is bevestigd met schroeven rond de randen. Als de schroeven worden verwijderd, kunnen de gaten worden gebruikt om vliegen te leveren in de kamer. Plaats de plexiglas boven, zodat het schroefgat zit direct boven de binnenste kamer in plaats van waar een schroef normaal zit. Neem een ​​reageerbuis met daarin de vliegen en plaats het ondersteboven over de trechter, die vervolgens moet worden geplaatst in het schroefgat.
4. Niet verplaatsen van de trechter, omdat dit zou kunnen kwetsen of schade aan het vliegen. In plaats daarvan voorzichtig klap de hele kamer, alle trechter en, totdat alle vliegen in de kamer. Dit kloppen moet worden gedaan op een muismat om de schok van deze bonzen op te vangen. Wanneer vliegt binnen zijn, verwijder dan de trechter, en opnieuw de positie van de plexiglas bovenkant over de schroef bedden. Dan re-schroef de plexiglas bovenkant op zijn plaats.

Deel 4: Running het bewegingsapparaat Assay

1. Zodra de vliegen correct is geladen, laat ze wennen in de kamer voor 30 minuten. Deze acclimatiseringsperiode dient plaats te vinden in de gecontroleerde omgeving (25 º C, 70% luchtvochtigheid), en de kamer moet worden geplaatst op de top van de lichtbak (die moeten worden ingeschakeld). Draai andere kamer lights off.
2. Na de acclimatiseringsperiode, schakelt u de Y-klep in de luchtstroom systeem zodanig dat de lucht alleen maar zullen terugvloeien naar de flowmeter. Zet de lucht en oprit van de lucht tot de gewenste snelheid (4,0-6,0 L / min). Wij gebruiken over het algemeen 5.0-5.5 L / min, maar elke snelheid in dit bereik zal werken.
3. Zodra de gewenste snelheid is bereikt, schakelt u de Y-klep, zodat de lucht stroomt naar de voortbeweging kamer. Keer dat deze lucht puls gedurende 15 seconden, en dan abrupt zet de lucht uit te schakelen. Als u de lucht uit, schakel de camera in de opnamestand. (Dit deel vergt oefening om alles te doen in een keer).
4. Stop de opname na de gewenste tijd en SAVE. We nemen 30 seconden proeven op 10 frames per seconde (minstens 8 trials per genotype).

Deel 5: Analyse van de video's

1. We gebruiken deDynamische Image Analysis System (DIAS)-software 3.2 voor motion tracking ^2. Om deze software te gebruiken, moeten we eerst onze video's converteren naar een AVI-bestandsformaat met Quicktime 7.5.5.
2. Op te sporen de vliegen op basis van contrast, gebruiken we de "autotrace door Threshold"-functie. We dan gebruik maken van de "Make pad van Trace" functie voor het digitaliseren van deze sporen.
3. Om de output van de onmiddellijke snelheden van elk vliegen, gebruiken we de 'Compute Parameters "functie om een ​​database-bestand te maken (DIAS-specifieke). Met behulp van deze functie, hebben we ook vlot de gegevens met behulp van een "5,15,60,15,5" Tukey Smoothing venster.
4. Zodra deze informatie is uitgestuurd als een database-bestand, kan het worden geopend in Microsoft Excel. We maken gebruik van een Matlab script op de momentane snelheden binnen Excel te compileren en extra parameters nodig zijn voor het begrijpen van rijdynamiek en bout de structuur te berekenen.

Representatieve resultaten:

Figuur 1 toont vertegenwoordiger sporen van wild-type Canton S organismen (figuur 1, links) en vliegt null voor de dCASK-gen, die werden gegenereerd door kruising van twee grote overlappende deleties (Df (3R) x307 en Df (3R) X313) (figuur 1 , rechter paneel). dCASK null vliegt eerder is aangetoond dat bewegingsapparaat problemen met Buridan's Paradigm ³ hebben, en in onze paradigma, in vergelijking met Canton S, laten zien dat ze sterk verminderd motoriek. We hebben altijd eerste run wild-type organismen om ervoor te zorgen dat de omstandigheden en het gedrag binnen de normale range op een bepaalde dag. We hebben waargenomen afwijkingen van de standaard reacties in minder dan 5% van de testdagen. Deze verschillen kunnen meestal worden toegeschreven aan problemen met de parameters van onze gecontroleerde omgeving.

Figuur 1. DIAS-generated sporen van zowel wild type Canton S vliegt (boven, links) en Locomotorische-deficiënt dCASK Null vliegt gegenereerd op basis van overlappende verwijderingen (boven, rechts). De sporen geven wat er te zien in de opgenomen video's. Beide foto's contra sporen 8-10 vliegt gedurende 30 seconden in de video-tracking test na een lucht-puls.

Figuur 2. Wild type vliegt werden uitgevoerd in het bewegingsapparaat assay (zie hierboven) na een lucht-puls (paars bars) en zonder een lucht-puls (blauw). In alle parameters berekend door de analyse-programma, waren er geen significante verschillen tussen de twee condities (bepaald met twee-tailed student t-test). Dit toont aan dat na een lucht-puls, vliegt normaal voortbewegen in onze setup.

In onze opstelling, een matig sterke lucht puls stopt tijdelijk vliegen beweging. Wanneer de lucht signaal eindigt, zijn de vliegen vrijgesteld van deze stationaire toestand en voortbewegen normaal, zoals weergegeven in figuur 2. Omdat deze lucht puls effectief synchroniseert motoriek van de bevolking, we gebruiken om het proces te beginnen, zodat we bestuderen ook het begin van beweging na een momentum-brekende stimulus. De test kan echter worden uitgevoerd zonder een lucht-puls, omdat het bewegingsapparaat parameters na de start worden niet beïnvloed door de lucht puls (figuur 2).

Een veelvoorkomend probleem gezien met geautomatiseerde analyse van de motoriek is het probleem van botsingen. Tracking programma's zijn voor het grootste deel notoir slecht in het omgaan met vliegen die botsen. Deze programma's vaak te verliezen "zicht" van een object even tijdens een botsing, en op het vinden van dit object label het als een nieuw object. Het resultaat kan een uitgang die veel meer voorwerpen opgespoord dan werkelijk bestaan ​​in de kamer zitten worden. Veel mensen lossen dit probleem op door het traceren van enkele vliegen. Voor de hand liggende probleem met deze, echter, is dat een vlieg gedrag kan heel anders zijn dan de bevolking het gedrag te wijten aan de rol van de sociale signalen in het gedrag en de motoriek Drosophila ^4. Dit is natuurlijk niet per se een slechte zaak, afhankelijk van wat u probeert te studeren, maar voor ons doel, we de voorkeur aan de bevolking van vliegen gebruiken om onze statistische power te vergroten. Vanwege dit, wij omgaan met botsingen op twee manieren. De eerste, alleen wij 80 tot 10 vliegt per trial (in onze 56 mm vierkante kamer) te gebruiken, zodat botsingen minimaal zal zijn. Ten tweede, binnen onze tweeëndertigste proeven, analyseren we alleen sporen die ten minste 18 seconden lang zijn. Door dit te doen, zijn we altijd op te nemen genoeg tijd om meerdere aanvallen van motion capture in hun geheel. Dit zorgt er ook voor dat onze steekproef altijd het aantal vliegen in een kamer weerspiegelt, als kleinere fragmenten van de beweging worden verwijderd en de totale lengte van de video is slechts 30 seconden.

Data-analyse kan het moeilijkste deel van dit hele proces. De belangrijkste stap van het analyseren tracking data is het bepalen van het verschil tussen geluid en beweging. DIAS (net als vele andere programma's) zal bijna nooit uitgang een snelheid van 0 mm / s, zelfs als de vlieg is gestopt met bewegen. Vanwege dit, is het belangrijk om de video's bekijken terwijl u naar de data-uitgang beeld voor beeld om te zien wanneer de organismen zijn eigenlijk in beweging, en wanneer ze dat niet zijn. In onze setup, alle snelheden lager dan 1 mm / s schijnen om ruis, die strookt met wat andere groepen met behulp van DIAS hebben gevonden met ^een volwassen vliegen worden. Voor het kijken naar de dynamiek van de bout structuur, moet men ook het definiëren van een bout. We definiëren activiteit als 3 of meer opeenvolgende frames van de snelheid meer dan 1 mm / s, en inactiviteit als 3 of meer opeenvolgende frames onder deze drempel.

De gegevens moeten ook goed worden gladgestreken, om artefacten van voorbijgaande lichte flikkering en camera verstoringen, die zich soms voordoen te elimineren. Er is geen standaard methode voor data glad, maar het is belangrijk dat de afvlakking niet de algemene trend van de gegevens te wijzigen te drastisch, of men kan genereren smoothing artefacten. We twee keer glad met een Tukey venster van "5,15,60,15,5", omdat het lijkt te elimineren grote sprongen of veranderingen in de snelheid die duidelijk verkeerd zijn, maar verandert niets aan de algemene trend of de aard van de gegevens.

Het is belangrijk te erkennen dat verschillende opstellingen en omgevingen zullen verschillende uitkomsten gedrag te produceren. Onze aanbeveling aan iedereen die het opzetten van een tracking test is om te experimenteren met al deze problemen totdat u een methode waarmee gegevens die overeenkomt met hetgeen men visueel kan zien, en dan worden zo consistent mogelijk bij de behandeling van alle gegevens op dezelfde manier produceert.

Selectie van de juiste tracking-programma is ook belangrijk. Hoewel we gebruik van DIAS 3.2 (www.solltechnologies.com), dit is zeker niet de beste of de enige systeem beschikbaar. Voor het volgen van enkele vliegen, heeft Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) ontwikkelde een programma genaamd Ftrack. Voor meerdere vliegt locomoting samen (dat wil zeggen waar de botsingen kunnen voorkomen), is Kristin Branson (Dickinson / Perona Labs, Caltech) ontwikkelde een programma genaamd Ctrax. Ftrack is beschikbaar op www.chronux.org, terwijl Ctrax is te vinden op www.dickinson.caltech.edu / Onderzoek / Mtrax. Ethovision software (Noldus, Nederland) is een andere krachtige optie beschikbaar voor video-tracking van zowel enkelvoudige als meervoudige vliegt, maar het is alleen commercieel beschikbaar, en is vrij duur.

Als u het opzetten van een tracking test en kan niet betrouwbaar zijn opnames, zijn er een paar dingen te overwegen. Circadiane ritme problemen zijn vaak een groot probleem. Bij het uitvoeren van gedrags-assays, moet men altijd zorgen dat NIET te vliegen lopen tijdens hun middag siësta. Aangezien we Currently geïnteresseerd zijn in genen die kunnen produceren dalingen in locomotorisch gedrag, geven we de voorkeur aan vliegen lopen in de buurt van de late namiddag activiteit piek (ZT 8-10). Een ander probleem kan ook het gevolg zijn van inconsistente luchtstroom van de bron. Voordat u begint met proeven, moet u de luchtstroom test met de flowmeter, zodat het niet zal sterk fluctueren over de 15 seconden lucht puls. Ten slotte genetische achtergrond kunnen een rol spelen in alle gedrag taken, zodat een aantal van de parameters van deze test kan dienen te worden geoptimaliseerd voor een specifieke achtergrond.