Suivi vidéo haute résolution de la locomotion chez les adultes Drosophila melanogaster

Partie 1: L'alimentation et la gestion des mouches

1. Les mouches doivent être cultivées dans des bouteilles contenant de la levure sans support standard. Vous aurez besoin d'un grand nombre de mouches, de sorte traverse besoin d'être mis en place en conséquence. Les mouches doivent être cultivées dans un 12-heures de lumière: obscurité du cycle à 25 º C.
2. Les mouches doivent être recueillis peu après l'éclosion (1-3 jours). Les mouches peuvent être travaillé avec à ce stade en utilisant un diffuseur de dioxyde de carbone, et doivent être triés dans des éprouvettes contenant des milieux autoclavés ou sans levure. Nous utilisons les mâles seulement, stocké 10 à un tube à essai.
3. Prévoyez au moins un ou deux jours après l'utilisation du dioxyde de carbone avant d'exécuter les expériences comportementales. Nous courons mouches dans notre test de comportement 3-5 jours suivants Eclosion.
4. Les analyses devraient toujours être fait dans le même fenêtre de temps de deux à trois heures chaque jour pour éviter les problèmes de rythme circadien.

Partie 2: Mise en place du système de suivi dans un environnement contrôlé

1. Toutes les expériences sont faites dans une salle de l'environnement qui maintient une température constante de 25 º C avec une humidité de 70%.
2. Suspendre une caméra vidéo numérique sur la zone à être enregistrées (caméra vers le bas). Depuis notre logiciel de suivi de contraste à base, nous suspendons la caméra sur une boîte à lumière. La caméra enregistre des vidéos directement sur un ordinateur Dell via une connexion FireWire. Nous utilisons une caméra vidéo numérique SHARP, relié à un ordinateur Dell avec Windows MovieMaker (version Vista) pour l'acquisition vidéo.
3. Impulsions d'air sera administré dans ce protocole, alors une source de flux d'air doivent être présents dans la salle. Utilisant des tubes en caoutchouc, connecter la source d'air à un filtre à charbon pour la filtration de l'air.
4. Utilisant des tubes plus de caoutchouc, connectez l'autre côté de la filtre à charbon dans un erlenmeyer au moyen d'un bouchon de caoutchouc creux, et remplissez le flacon avec environ un demi-pouce d'eau. Ce sera humidifier l'air.
5. Le flacon devrait également avoir une arme de poing, qui sera connecté à une valve en forme de Y via un tube en caoutchouc.
6. Une branche de la Y-valve doit être connecté à un débitmètre. L'autre branche devrait fournir de l'air dans la chambre de la locomotion carrés.

Partie 3: Offrir des mouches dans la chambre de la locomotion

1. La chambre de la locomotion carré est basé sur la conception de Wolf et al. 2002 ^1, avec l'ajout de bacs petite goutte pour empêcher les mouches de voler dans la chambre. La chambre doit être pris à part, et tous les composants doivent être soigneusement essuyées avec 70% d'éthanol et séché avant utilisation.
2. Anesthésie immédiatement avant la réalisation d'une analyse comportementale peut potentiellement compromettre la performance. Pour éviter cela, les mouches sont frappa doucement dans la chambre en utilisant un entonnoir avec un petit point de vente. Pour faire une sortie de la bonne taille, attachez une pointe bleue pipette (pour P1000) à la fin d'un entonnoir. Utilisez des ciseaux pour couper la fin de la pointe de la pipette pour faire l'ouverture assez grande pour un avion pour passer à travers.
3. Le haut de notre chambre est un petit morceau de plexiglas fixé par des vis sur les bords. Lorsque les vis sont retirées, les trous peuvent être utilisés pour fournir des mouches dans la chambre. Placez le dessus en plexiglass afin que le trou de la vis se trouve directement sur la chambre intérieure au lieu de l'endroit où se trouve une vis normalement. Prenez un tube à essai contenant les mouches et le placer à l'envers sur l'entonnoir, ce qui devrait ensuite être placé dans le trou de la vis.
4. Ne déplacez pas l'entonnoir, ce qui pourrait blesser ou endommager les mouches. Au lieu de cela, doucement Bang toute la chambre, l'entonnoir et tous, jusqu'à ce que toutes les mouches sont à l'intérieur de la chambre. Cette frappe doit être fait sur un tapis de souris pour absorber le choc de ce baiser. Quand les mouches sont à l'intérieur, retirez l'entonnoir, et re-positionner le haut en plexiglas sur les lits à vis. Puis re-vis de la partie supérieure en plexiglas en place.

Partie 4: Exécution du test locomoteur

1. Une fois que les mouches sont bien chargées, les laisser s'acclimater dans la chambre pendant 30 minutes. Cette période d'acclimatation devrait avoir lieu dans l'environnement contrôlé (25 ° C, humidité 70%), et la chambre doit être placé sur le dessus de la boîte à lumière (qui devrait être allumé). Éteindre les lumières autre pièce off.
2. Après la période d'acclimatation, changer le Y-valve dans le système de circulation d'air de telle sorte que l'air ne écoulement vers le débitmètre. Allumez l'air, et la rampe de l'air jusqu'à la vitesse souhaitée (de 4,0 à 6,0 L / min). Nous utilisons généralement de 5,0 à 5,5 L / min, mais toute vitesse dans cette plage de travail.
3. Une fois la vitesse désirée est atteinte, passer le Y-vanne de sorte que l'air circule dans la chambre de locomotion. Temps de cette impulsion de l'air pendant 15 secondes, et puis brusquement son tour l'air éteint. Lorsque vous tournez l'air éteint, allumez l'appareil photo au mode d'enregistrement. (Cette partie prend la pratique de faire tout à la fois).
4. Arrêtez l'enregistrement après l'heure désirée et SAVE. Nous enregistrons 30 essais seconde à 10 images par seconde (au moins 8 essais par génotype).

Partie 5: Analyse des vidéos

1. Nous utilisons lesDynamic System Image Analysis (DIAS) 3.2 pour le logiciel de suivi de mouvement ^2. Pour utiliser ce logiciel, nous avons d'abord convertir nos vidéos en un format de fichier AVI avec Quicktime 7.5.5.
2. Pour suivre les mouches basée sur le contraste, nous utilisons le «Seuil Autotrace par" la fonction. Nous utilisons ensuite le "Chemin du Faire trace" afin de numériser ces traces.
3. Pour la sortie de la vitesse instantanée de chaque volée, nous utilisons le "calculer les paramètres" pour fonction de produire un fichier de base (DIAS-spécifique). En utilisant cette fonction, nous avons également lisser les données en utilisant un "5,15,60,15,5" Lissage de Tukey fenêtre.
4. Une fois que cette information est délivrée comme un fichier de base, il peut être ouvert dans Microsoft Excel. Nous utilisons un script Matlab pour compiler les vitesses instantanées dans Excel et calculer les paramètres supplémentaires nécessaires à la compréhension dynamique des mouvements et la structure combat.

Les résultats représentatifs:

La figure 1 montre des traces d'organismes représentatifs du type sauvage Canton S (figure 1, le panneau de gauche) et les mouches nulles pour le gène dCASK qui ont été générés par le croisement de deux grandes suppressions qui se chevauchent (Df (3R) X307 et Df (3R) X313) (figure 1 , panneau de droite). mouches nulle dCASK ont déjà été montré pour avoir l'aide de problèmes locomoteurs paradigme de Buridan ^3, et dans notre paradigme, par rapport à Canton S, ils montrent fortement diminué locomotion. Nous effectuons toujours des organismes de type sauvage d'abord pour s'assurer que les conditions et le comportement sont dans la fourchette normale pour un jour donné. Nous avons observé des écarts de réponses standard en moins de 5% des journées d'essais. Ces différences peuvent généralement être attribués à des problèmes avec les paramètres de notre environnement contrôlé.

Figure 1. DIAS généré des traces de deux mouches Canton S de type sauvage (ci-dessus, à gauche) et Null dCASK locomoteur déficient mouches générés par des suppressions qui se chevauchent (ci-dessus, à droite). Les traces représentent ce qui est vu dans les vidéos enregistrées. Les deux traces photos contrain 8-10 mouches fonctionner pendant 30 secondes dans l'épreuve de poursuite vidéo suite à une impulsion de l'air.

Figure 2. Mouches de type sauvage ont été exécutés dans le test locomoteur (ci-dessus) après une impulsion de l'air (barres pourpres) et sans une impulsion d'air (en bleu). Dans tous les paramètres calculés par le programme d'analyse, il n'y avait aucune différence significative entre les deux conditions (déterminé par deux queues test t de Student). Cela démontre que, suite à une impulsion de l'air, les mouches locomote normalement dans notre configuration.

Dans notre configuration, une impulsion d'air assez fort mouvement s'arrête transitoirement voler. Lorsque l'impulsion de l'air se termine, les mouches sont libérés de cet état stationnaire et locomote normalement, comme le montre la figure 2. Parce que cette impulsion d'air synchronise de manière efficace la locomotion de la population, nous l'utilisons pour commencer le procès, de sorte que nous pouvons également étudier le début du mouvement suite à un stimulus élan révolutionnaire. Le dosage peut, toutefois, être fait sans une impulsion d'air puisque les paramètres locomoteurs après l'initiation ne sont pas affectés par l'impulsion de l'air (figure 2).

Un problème fréquent vu avec l'analyse automatisée de locomotion est la question de la collision. Programmes de suivi sont pour la plupart, notoirement mauvaises à traiter avec des mouches qui entrent en collision. Ces programmes sont souvent perdre "de vue" d'un objet momentanément lors d'une collision, et sur cette étiquette de trouver l'objet comme un nouvel objet. Le résultat peut être une sortie qui a beaucoup plus d'objets que les tracés existent réellement dans la chambre. Beaucoup de gens à résoudre ce problème en traçant mouches unique. Le problème évident avec cela, cependant, est que le comportement seule mouche peut être très différent du comportement de la population en raison du rôle des indices sociaux dans le comportement et la locomotion chez la drosophile ^4. Ceci est, bien sûr, pas nécessairement une mauvaise chose, selon ce que vous essayez d'étudier, mais pour nos fins, nous préférons utiliser des populations de mouches pour augmenter notre puissance statistique. Pour cette raison, nous traitons avec des collisions de deux manières. Tout d'abord, nous n'utilisons que de 80 à 10 mouches par l'essai (dans notre chambre à 56 mm ²), alors que les collisions seront minimes. Deuxièmement, au sein de nos trente secondes d'essais, nous avons seulement analyser les traces qui sont au moins 18 secondes. En faisant cela, nous sommes toujours assez de temps pour enregistrer la capture des épisodes multiples de mouvement dans leur intégralité. Cela garantit également que la taille de notre échantillon reflète toujours le nombre de mouches dans une chambre, les petits fragments de mouvement sont jetés et la longueur totale de la vidéo est à seulement 30 secondes.

L'analyse des données peut être la partie la plus difficile de tout ce processus. L'étape la plus importante de l'analyse des données de suivi est de déterminer la différence entre le bruit et le mouvement. DIAS (comme beaucoup d'autres programmes) ne sera presque jamais sortie une vitesse de 0 mm / s, même si la mouche a cessé de bouger. Pour cette raison, il est important de regarder les vidéos tout en regardant l'image de sortie de données par image pour voir quand les organismes sont réellement en mouvement, et quand ils ne sont pas. Dans notre configuration, toutes les vitesses inférieures à 1 mm / s semblent être du bruit, ce qui est cohérent avec ce que d'autres groupes utilisant DIAS avons trouvé avec ^une mouches adultes. Pour regarder la dynamique de la structure de combat, on a aussi besoin de définir un combat. Nous définissons l'activité de 3 ou plusieurs trames consécutives de vitesse supérieure à 1 mm / s, et l'inactivité de 3 ou plusieurs trames consécutives en dessous de ce seuil.

Les données doivent également être correctement lissées pour éliminer les artefacts de scintillement de lumière passagère et les distorsions caméra, qui surviennent parfois. Il n'existe aucune méthode standard pour les données de lissage, mais il est important que le processus de lissage ne modifie pas la tendance générale des données de manière exagérée, ou l'on peut générer des artefacts de lissage. Nous en douceur à deux reprises avec une fenêtre de Tukey de «5,15,60,15,5", parce qu'il semble éliminer tout grands sauts ou les changements de vitesse qui sont clairement faux, mais ne change pas la tendance générale ou la nature des données.

Il est important de reconnaître que les configurations et des environnements différents va produire différents résultats comportementaux. Notre recommandation à quiconque mettre en place un test de suivi est d'expérimenter avec toutes ces questions jusqu'à trouver une méthode qui produit des données qui correspond à ce qui peut être vu visuellement, puis être aussi cohérente que possible dans le traitement de toutes les données de la même manière.

Sélection du programme de suivi droite est également importante. Bien que nous utilisions DIAS 3.2 (www.solltechnologies.com), ce n'est pas le meilleur ou le seul système disponible. Pour le suivi de mouches unique, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) a développé un programme appelé FTrack. Pour plusieurs mouches locomoting ensemble (ie, où les collisions pourraient se produire), Kristin Branson (Dickinson / Labs Perona, Caltech) a développé un programme appelé Ctrax. FTrack est disponible à www.chronux.org, tandis Ctrax est disponible à www.dickinson.caltech.edu / Recherche / Mtrax. Ethovision logiciel (Noldus, Pays-Bas) est une autre option puissant disponible pour le suivi vidéo des mouches à la fois uniques et multiples, mais il est seulement disponible dans le commerce, et est assez cher.

Si vous avez mis en place un test de suivi et ne peuvent pas obtenir des enregistrements fiables, il ya quelques choses à considérer. Problèmes du rythme circadien sont souvent un gros problème. Lors de l'exécution des tests de comportement, on doit toujours s'assurer de ne pas courir mouches durant leur sieste. Puisque nous sommes currently intéressés à des gènes qui peuvent produire des baisses de comportement locomoteur, nous préférons courir mouches près du pic d'activité fin d'après midi (ZT 8-10). Un autre problème peut également provenir de la circulation d'air incompatibles de la source. Avant les essais de départ, n'oubliez pas de tester le débit d'air avec le débitmètre, de sorte qu'il ne sera pas fluctuer énormément au cours de la pulsation de l'air 15 secondes. Enfin, le contexte génétique peut jouer un rôle dans toutes les tâches de comportement, de sorte que certains paramètres de ce test peut-être besoin d'être optimisé pour un fond particulier.