Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Bölüm 1: sinek Besleme ve Yönetim

1. Sinekler, maya-standart medya içeren şişelerde yetiştirilen olmalıdır. Bu sinekler çok sayıda ihtiyaç, bu yüzden haçlar buna göre ayarlanması gerekir. 25 º C'de karanlık döngüsü: Sinekler, 12 saat ışık altında yetiştirilen olmalıdır
2. Sinekler, kısa bir süre eclosion sonra (1-3 gün) alınmalıdır. Sinekler Bu aşamada az karbondioksit difüzör ile birlikte çalıştı ve otoklav veya maya-medya içeren test tüpleri içine sıralanır olmalıdır. Biz, sadece, saklı erkeklerde 10 bir test tüpünde kullanın.
3. Davranışsal deneyler çalıştırmadan önce karbon dioksit kullanımdan sonra en az bir veya iki gün izin verin. Biz ECLOSION takiben 3-5 gün bizim davranış tahlil sinek çalıştırın.
4. Tahliller sirkadiyen ritim sorunları önlemek için her zaman aynı 2-3 saatlik zaman penceresi her gün içinde yapılmalıdır.

Bölüm 2: kontrollü bir ortamda izleme sistemi kurma

1. Bütün deneyler,% 70 nem oranı ile 25 º C sabit sıcaklık sağlayan bir ortam odada yapılır.
2. Askıya alma (kamera aşağı bakacak şekilde) kayıt altına alan üzerinde bir dijital video kamera. Bizim izleme yazılımı kontrast tabanlı olduğu için, bir ışık kutusu üzerinde kamera askıya aldı. Kamera kayıtları videoların doğrudan bir firewire bağlantısı üzerinden bir Dell bilgisayar üzerine. Biz bir Dell bilgisayar, Windows MovieMaker ile bağladım video edinimi için bir Sharp dijital video kamera, (Vista sürümü) kullanın.
3. Hava bakliyat bu protokolü uygulanmalıdır, hava akışı için bir kaynak odasında mevcut olmalıdır. Kauçuk borular kullanarak, hava filtreleme için bir karbon filtre hava kaynağı bağlamak.
4. Daha fazla kauçuk borular kullanarak, içi boş bir lastik tıpa ile bir Erlenmeyer şişesinin karbon filtresi diğer tarafında bağlanmak ve su yaklaşık bir buçuk inç şişeyi doldurun. Bu hava nemlendirme.
5. Balon tabancası, kauçuk borular aracılığı ile Y-şekilli kapak bağlanmak olmalıdır.
6. Y-valf bir dal, bir debimetre bağlı olmalıdır. Diğer şube kare lokomosyon odasına hava ulaştırmaları gerekmektedir.

Bölüm 3: lokomosyon odasına sinek teslim

1. Kare lokomosyon odası, Wolf ve ark tasarım ²⁰⁰² 1, odanın içinde uçan sinek önlemek için küçük bir damla tepsiler ilavesi ile . Odasının dışında alınacak ve tüm bileşenleri,% 70 etanol ile iyice sildi ve kullanmadan önce kurutulmuş olmalıdır.
2. Anestezi, hemen davranışsal analiz yapmadan önce potansiyel performansı bozabilir. Bunu önlemek için, sinek küçük bir çıkış ile bir huni kullanarak odasına yavaşça serdi. Doğru büyüklükte bir çıkış yapmak için, bir huni sonuna kadar mavi pipet ucu (P1000) ekleyebilirsiniz. Geçmesi için yeterli bir sinek açılış büyük yapmak için pipet ucu sonuna kesmek için makas kullanın.
3. Odamızın üst kenarlarında vida ile sabitlenir pleksiglas küçük bir parça. Vidaları çıkarılır, delikler sinekler odasına teslim etmek için kullanılabilir. Vida deliği bir vida normal oturur yerine doğrudan iç haznesi üzerinde oturur böylece pleksiglas üst konumda. Sineklerin içeren bir test tüpü alın ve sonra vida deliği konulmalıdır huni üzerinde baş aşağı yerleştirin.
4. Bu sinekler zarar veya zarar verebilir, huni hareket yapmayın. Bütün sinekler odasının içine kadar yerine yavaşça, tüm, tüm oda bang huni ve. Bu çalıyor bu beceriyor şok absorbe etmek için bir mouse pad yapılmalıdır. Sinekler içinde iken, huni kaldırmak ve pleksiglas üst vida yatakları üzerinde yeniden konumlandırın. Yerleştirin sonra yeniden pleksiglas üst vida.

Bölüm 4: lokomotor Testi Koşu

1. Sinekler düzgün bir şekilde yüklendikten sonra, onlara 30 dakika boyunca odasına gelmesini sağlar. Bu aklimasyonundan süre kontrollü bir ortamda (25 º C,% 70 nem) yer almalı ve odanın ışık kutusunun üstünde yer almalıdır (açık olmalıdır). Diğer oda ışıkları kapatın.
2. Aklimasyonundan döneminin ardından, hava debimetre akacaktır, hava akış sistemi Y-valf geçiş. Hava açın ve istenilen hızı (4,0-6,0 L / dk) hava kadar rampa. Biz genellikle 5.0-5.5 L / dk, ancak bu aralıktaki herhangi bir hızda çalışacak kullanın.
3. İstenen boranasi elde sonra hava lokomosyon odasına akar, böylece, Y-valf geçin. Zaman bu hava 15 saniye boyunca nabız ve sonra aniden hava kapatmak. Hava kapatmak, kamera kayıt moduna geçiş yapın. (Bu bölüm, tek seferde her şeyi pratik gerektirir).
4. Kaydı durdurmak ve istenilen süre sonra SAKLAYIN. Biz, saniyede 10 kare (genotip için en az 8 çalışma) 30 saniyelik çalışmalarda kayıt.

Bölüm 5: Video Analizi

1. Biz kullanımıDinamik Görüntü Analiz Sistemi (DİAS) ² hareketi izleme yazılımı 3.2. Bu yazılımı kullanmak için, öncelikle Quicktime 7.5.5 ile videolarınızı AVI dosya biçimi dönüştürmek.
2. Kontrast dayalı sinekler izlemek için, fonksiyon "Eşik tarafından autotrace" kullanın. Daha sonra bu izleri dijital ortama aktarmak için fonksiyon "İzleme olun Yol" kullanabilirsiniz.
3. Her sineğin anlık hızları çıkış için, bir veritabanı dosyası (DİAS özel) üretmek için "Compute Parametreleri" fonksiyonunu kullanabilirsiniz. Bu işlevi kullanarak, biz de bir "5,15,60,15,5" Tukey Smoothing Pencere kullanarak veri pürüzsüz.
4. Bu bilgileri bir veritabanı dosyası olarak outputted sonra, Microsoft Excel'de açılabilir. Biz excel içinde anlık hızları derlemek ve hareket dinamiklerini ve butik yapısını anlamak için gerekli ek parametreleri hesaplamak için bir Matlab komut dosyası kullanabilirsiniz.

Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1, vahşi tip Kanton G organizmalar (Şekil 1, sol panel) temsilcisi izlerini gösterir ve iki büyük örtüşen silmeler (Df (3R) x307 ve Df (3R) x313) (Şekil 1 geçerek oluşturulan dCASK gen için null uçar , sağ panel). dCASK boş sinekler daha önce Kanton S ile karşılaştırıldığında, Buridan Kullanıcı ^Paradigma 3 kullanarak lokomotor sorunlar var, ve bir paradigma olmuştur, bunlar büyük ölçüde hareketlilik azalma göstermektedir . Biz her zaman koşullar ve davranış, belirli bir günde normal aralık içinde olduğundan emin olmak için ilk vahşi tip organizmalar çalıştırmak. Biz test gün% 5'inden az, standart tepkileri sapmalar gözlemledik. Söz konusu farklılıklar genellikle bizim kontrollü bir ortamda parametreleri ile ilgili sorunlar isnat edilebilir.

Şekil 1 DİAS oluşturulan Kanton G vahşi tür sinek (üstte, solda) ve üst üste silmeler (üstte, sağda) ile oluşturulan lokomotor eksikliği dCASK Boş uçar hem de izleri. Izleri kaydedilen videoları görülür temsil eder. 8-10 sinekler iki resim contrain bir hava darbesinin izlerini aşağıdaki video izleme tayininde 30 saniye boyunca çalışır.

Şekil 2 Wild tip sinekler, bir hava nabız (mor çubuklar) lokomotor assay (üstte) ve bir hava darbesi (mavi) olmadan çalıştırmak . Analiz programı tarafından hesaplanan tüm parametreler, bu iki durum arasında anlamlı bir fark (iki kuyruklu Student t-testi ile belirlenen) vardı. Bu, kurulum normal bir hava darbe sonrasında locomote uçar göstermektedir.

Kurulumda, orta derecede güçlü bir hava nabız geçici fly hareketini durdurur. Hava darbe sona erdiğinde, sinekler, Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu durağan durum ve normal locomote serbest bırakılır. Bu hava darbe etkili nüfusun lokomosyon senkronize Çünkü, biz, biz de bir ivme kıran uyaranı takiben hareket başlangıcında çalışma böylece deneme başlamak için de kullanabilirsiniz. Başlanmasının ardından, lokomotor parametreleri hava darbesi (Şekil 2) etkilenmez beri tahlil, ancak, bir hava darbe olmadan yapılabilir.

Lokomosyon otomatik analizi ile görülen bir problem sık sık meydana gelen çarpışmalar konudur. Izleme programları çarpışır sinekleri ile ilgili herkesin bildiği gibi kötü çoğunlukla. Bu programlar, genellikle bir çarpışma sırasında anlık bir nesne "görme" kaybetmek ve yeni bir nesne olarak bu nesne etiket bulmak üzerine. Sonuç olarak, aslında odasında var daha izlenebilir daha birçok nesneleri bir çıkış olabilir. Birçok kişi tek bir sinek takip ederek bu sorunu çözebilir. Bu bariz bir sorun, ancak bu tek sinek davranış, sosyal ipuçlarını Drosophila davranış ^ve hareket 4 rolü nedeniyle nüfus davranışı çok farklı olabilir. Bu, tabii ki, çalışmak için çalışıyoruz ne bağlı olarak, mutlaka kötü bir şey değil, ama bizim açımızdan, biz sinek nüfusu bizim istatistiksel gücü artırmak için kullanmayı tercih. Bu nedenle, biz iki şekilde çarpışmalar ile anlaşma. Öncelikle, sadece deneme ortalama 8-10 sinekler (56 mm ² kamara) kullanır, böylece çarpışmalar az olacaktır. İkincisi, bizim otuz ikinci denemelerinde içinde, sadece, en az 18 saniye uzunluğunda izleri analiz. Bunu yaparak, biz her zaman kendi bütünlüğü içinde birden fazla hareket nöbetleri yakalamak için yeterince zaman kayıt. Bu aynı zamanda hareketin küçük parçaları atılır ve video toplam uzunluğu sadece 30 saniye gibi örneklem büyüklüğü her zaman bir oda sinek sayısı yansıttığını sağlar.

Veri analizi, tüm bu sürecin en zor bir parçası olabilir. Izleme verilerini analiz en önemli adım, gürültü ve hareket arasındaki farkı belirlemek için. DİAS (birçok diğer programlar gibi) anında hareket etmiyorsa bile, 0 mm / s hız çıktı hemen hemen hiç. Bu nedenle, veri çıkışı çerçevesi organizmalar hareket aslında görmek için kare bakarken videoları izlemek için önemli olduğunu ve ne zaman değiller. 1 mm / sn altındaki tüm hızlar bizim kurulum, gürültü, yetişkin sinekler ¹ bulduk DİAS kullanarak diğer gruplar ile tutarlı gibi görünüyor. Nöbeti yapının dinamiklerine bakarak için, aynı zamanda bir butik tanımlamak gerekir. Biz bu eşiğin altında 3 veya daha fazla kare olarak üst üste 3 veya daha fazla ardışık 1 mm / s hız kare ve hareketsizlik olarak faaliyet tanımlar.

Veriler de düzgün bir şekilde, geçici ışığı titreşen ve ara sıra meydana gelen kamera çarpıklıklar, bozulmaları ortadan kaldırmak için düzeltilmelidir. Veri yumuşatmak için standart bir yöntem var, ancak yumuşatma işlemini veri çok büyük ölçüde genel eğilim değişmez önemlidir, ya da bir yumuşatma eserler üretebilir. Biz bunu açıkça yanlış olan herhangi bir büyük hız atlar ya da değişiklik yok gibi görünüyor, çünkü, "5,15,60,15,5" bir Tukey pencere ile iki kez düz, ancak verilerin genel eğilim ya da doğanın değişmez.

Farklı kurulumları ve ortamlar farklı davranışsal sonuçlar üretecektir kabul etmek önemlidir. Maçları görsel olarak görülen ve daha sonra tüm veriler aynı şekilde tedavi mümkün olduğunca tutarlı olması ne bu veriyi üreten bir yöntem bulana kadar herkes için bir izleme tahlil kurma Bizim tavsiyemiz, bu konularda deneme.

Doğru bir izleme programı seçimi de önemlidir. DİAS 3.2 (www.solltechnologies.com) kullanmasına rağmen, bu hiç iyi ya da sadece sistem anlamına gelir. Tek sinek izleme için, Dan Valente (Mitra Lab, CSHL) Ftrack denilen bir program geliştirmiştir. Birden fazla (yani çarpışmalar meydana gelebilir) bir araya locomoting sinekler için, Kristin Branson (Dickinson / Perona'yla Labs, Caltech) Ctrax denilen bir program geliştirmiştir. Ctrax www.dickinson.caltech.edu / Araştırma / Mtrax mevcut iken Ftrack www.chronux.org az kullanılabilir. Ethovision yazılımı (Noldus Hollanda), tekli ve çoklu sinekler video izleme için başka güçlü bir seçenek, ama sadece ticari olarak kullanılabilir, ve oldukça pahalı.

Bir izleme tahlil ve güvenilir kayıtlar alamayan, dikkate alınması gereken birkaç şey vardır. Sirkadiyen ritim sorunları genellikle büyük bir sorun. Davranış testleri çalıştırırken, her zaman onların öğle siesta sırasında sinek çalıştırmak değil emin olmalısınız. Curre olduğundanntly lokomotor davranış azalır üretebilir genler ilgi, öğleden sonra aktivitesi zirveye yakın (ZT 8-10) sinekler çalıştırmak için tercih ediyor. Bir başka sorun da, kaynaktan gelen tutarsız hava akımı ortaya çıkabilir. Başlayan çalışmalarda önce, 15 saniye havada darbe üzerinden büyük dalgalanma olmaz böylece hava akımı, debimetre ile test etmeyi unutmayın. Son olarak, genetik arka plan, tüm davranış görevleri bir rol oynayabilir, bu yüzden bu testin bazı parametrelerin belirli bir arka plan için optimize edilmesi gerekebilir.