Homing гемопоэтических клеток в костном мозге

1. Мы начинаем эксперимент самонаведения, извлекая клетки, которые будут использоваться в эксперименте. Для этого течения эксперимента мы заинтересованы в поиске, если самонаведения целых костного мозга ниши в длинных костях получателя животных различна для клеток костного мозга извлекается из WT животных, таких как C57BL/6J (WT) и те, которые являются трансгенными нокаутами для Lysophosphatidic рецепторов 1 (LPAR1) (KO).
2. Прежде чем мы начнем эксперимент, мы будем собирать материалы нам нужно для этого эксперимента. В нашей лаборатории все мыши вскрытия проводятся в ткани ламинарным потоком капота культуры особенно если клетки будут пересажены в животного-реципиента, а не используется для бывших естественных условиях анализа. Начнем с размещения синий лист внутри капота. Другие объекты, необходимые включают пару щипцов и резкое ножницами, которые были в автоклаве, стерильных одноразовых скальпеля и спиртовые тампоны. Нам потребуется изменение PBS и стерильные 6 лунками, миномет, пестик, 50cc синий превысила конической трубе и 70uM одноразовый фильтр.
3. Мы начнем с того, один и один WT KO мыши.
4. Эти мыши эвтаназии СО ₂ вдоха и затем погружают в 70% isopropranolol течение 5 секунд. Этот шаг предотвращает загрязнение клетки интересов с мышью меха и в наших руках, не привело к какой-либо компромисс в выход клеток или экспериментальных результатов.
5. Мышей затем расчлененный, в свою очередь с помощью пары щипцов и острые ножницы. Обычно мы начинаем с WT мышь, как рутинной. Небольшой надрез выполнен в вентральной кожи мыши вышележащих живота и кожа растягивается, то использование рук. Кожа сходит задние конечности легко. Бедра и голени извлекаются осторожно, чтобы не сместить головки бедренной кости, как он содержит большое количество костного мозга. Верхних конечностей отделены от туловища животного путем простого применения тягу к ним, сохраняя при этом туловище неподвижным. При этом удаляются верхние конечности, как одно целое. Плечевой кости извлекаются из верхних конечностей.
6. Удалены кости находятся в модифицированной PBS, который был добавлен к 6 и пластин. Измененный PBS производится путем добавления 2 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мл 0,5 М ЭДТА PH8. Это решение затем фильтруют через Nalgene 0,45 мкм фильтр и может храниться при температуре 4 градуса по Цельсию, по крайней мере месяц.
7. Важно, чтобы маркировать скважин в пластину для того, чтобы быть в состоянии идентифицировать WT и КО кости правильно.
8. Мышь туш удаляются и утилизируются.
9. Новый лист помещается в капот и кости чистить с помощью одноразовых скальпеля.
10. Очищать кости располагаются одна мышь на время в раствор. Два мл PBS изменение добавляется в раствор и кости дробятся помощью пестика. Важно, чтобы первый фрагмент кости по 10 туда-сюда движений пестиком, а затем стереть в порошок их круговыми вращательными движениями. Я обычно делаю 50 по часовой стрелке, затем против часовой стрелки, 50 движений и так далее, пока материал остается в раствор имеет белый цвет и изменение PBS добавлен материал остается белым или прозрачным.
11. После каждого набора из 50 круговых движений дробления, мы будем передавать жидкость из раствора в 70 мкМ фильтре, расположенном на вершине 50 мл коническую трубку. Не забудьте добавить 2 мл PBS, чтобы раствор после каждой передачи фильтра. Вы же не хотите, чтобы попытаться стереть в порошок сухие кости или оставить их сухими в течение длительного времени, так как это приведет к апоптозу клеток.
12. Как только материал в раствор становится белым, материал фильтра передается в ступке и дробления снова выполняется. Это гарантирует, что клетки в фильтр не были потрачены впустую. Обычно это занимает один или два комплекта круговые вращательные движения, чтобы снова сделать материал в раствор белого цвета, на которой время извлечения клеток является полным.
13. Раствора в конической трубе теперь центрифугировали (пожалуйста, не забудьте сохранить клетки WT и КО мыши отдельно. Следовательно, вы будете иметь два различных трубах (один с WT клеток, другие с клетками KO). Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут.
14. Аспирируйте от супернатанта с использованием отдельных пипетки аспиратор для каждой трубки. Добавьте 2 мл буфера для лизиса ACK для каждой таблетке. Это лизис буфера должны быть стерильными. Инкубировать на льду в течение 5 минут.
15. Добавить 8 вв модифицированных PBS в каждую пробирку. Возьмите 10 мкл из каждой пробирки и пипетки на два отдельных скважин в 96 ячейках. Место труб в центрифуге и спина их при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут.
16. В то время как трубы спиннинг, добавить 30 мкл tryphan синего красителя и 60 мкл PBS изменение в каждую лунку 96-луночный планшет, который несет клетки интерес.
17. Добавьте 10 мкл этой смеси (пожалуйста, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз), чтобы гемоцитометра и считать клетки в четыре внешних квадратов.
18. Подсчет клеток в каждой пробе на мл является количество клеток таким образом рассчитывал разделить на 4 и multiplieг на 100 000.
19. После центрифугирования завершения удаления труб из центрифуги и ресуспендирования клеток в ФСБ без кальция, магния или L глутамина в концентрации 20 млн. клеток на мл. Вы, вероятно, около 5 мл объема для WT и 5 мл объема для животных нокаутом. С этого шага вперед мы будем использовать PBS, не изменяется PBS для протокола.
20. Для каждой пробирки добавить DII, краситель ячейки окрашивания, для достижения конечной концентрации 5um. Vortex сразу на 10 секунд. Инкубировать при температуре 37 градусов в течение 10 минут и избегать воздействия света.
21. Заполните трубы с PBS и спина в течение 10 минут при 1200 оборотах в минуту.
22. После центрифугирования супернатант аспирации и ресуспендирования клеток в PBS в 40 миллионов клеток на миллилитр.
23. Нагрузка 500 мкл в 1 мл шприца с иглой 27G (5 шприцев для WT мыши и 5 шприцев для мышей KO). Это может быть разумным подготовить 6 шприцов для каждой когорты. Имея одну дополнительную может помочь как хвостовую вену инъекции, которые мы собираемся делать дальше, может быть сложнее.
24. Обложка шприцы с фольгой, чтобы сохранить DII от распада.
25. Inject 500 мкл Смесь клеток в каждую животного-реципиента; (5 для каждой группы).
26. Эти животные должны быть облученным с 9 Гр облучения 4-24 часа до инъекции.
27. 48 часов после инъекции, урожай костного мозга от задних конечностей каждого животного-реципиента.
28. Процесс, как описано выше, для доноров. Ресуспендируют клетки от каждого животного в 1 мл PBS. Получить клеток использованием hemacytometer.
29. Читайте на поток ЛСР II цитометр из БД или эквивалентный инструмент. Результат может быть выражен как процент или абсолютное количество клеток в костном мозге проанализированы которые DII положительным.

Homing является процесс, при котором клетки костного мозга, в том числе стволовых клеток, клеток-предшественников и дифференцированных клеток, их путь в костном мозге после введения в поток крови или костного мозга полость мышей. Как видно из определения, ученый может выбрать для изучения самонаведения гемопоэтических стволовых клеток, клеток-предшественников или дифференцированные клетки определенных иммунофенотипирования и изолированы от сортировки клеток. Обычно ученые вводят клеток костного мозга для обедненного линии маркеров и, следовательно, обогащенные для предшественников и стволовых клеток.

Доза клетки интерес вводится переменная в этом эксперименте. Количество клеток может варьировать от 500 000 на одного получателя мыши до 20 миллионов в получателями мыши. Чем больше клеток можно вводить легче обнаружение в костном мозге. Наличие сотовый номер может ограничить количество инъекций. Сортировка 20 миллионов ЛКС SLAM клетки крайне сложно, возможно, даже непрактичным с современными технологиями в большинстве лабораторных условиях, в случае чего можно было бы принять решение об использовании количество клеток по отношению к нижней части диапазона, приведенные выше.

Шланг животных, в которых самонаведения изучается также могут быть разнообразны. Это животного-реципиента могут быть мыши WT C57BL/6J который был смертельно облученных с 9 Грейс излучения, как мы делали в этом эксперименте, мыши WT C57BL/6J или W / Wv мыши, которые не были облучены. Ли мышь облученных или нет, зависит от вопроса экспериментатор пытается ответить. Если кто-то заинтересован в изучении самонаведения в условиях, когда большое количество цитокинов в настоящее время выпущен и сосудистой утечки, вынуждающие, облученные мыши WT является подходящим выбором. Меньшее количество клеток (500 000) может быть введен в WT мышь, которая не была облученные, так что стволовые клетки могут домом для небольшого числа незанятых ниш, не выше факторы.

W / Wv мышей являются несовершенными в с-KIT рецептор функции и может прививать стволовых клеток без каких-либо предварительной подготовки. Это позволяет нам изучать самонаведения стволовых клеток в отсутствии повреждения сосудов или цитокина, вызванных радиацией. Логистические проблемы с использованием этих мышей является то, что трудно получить достаточное число мышей WWV в качестве получателей из-за размножения колонии касается размера.

Короче говоря, хотя мы описываем стандартный самонаведения протокол, используемый вариации зависит от вопроса, требующие ответа и должны быть определены в ходе проектирования эксперимента.