Homing av hematopoetiska celler i benmärgen

1. Vi börjar målsökande experiment genom att extrahera celler som skall användas i experimentet. För detta aktuella experimentet är vi intresserade av att veta om det målsökande av hela benmärgen att de nischer de långa benen av mottagare djur är olika för benmärgsceller ur WT djur som C57BL/6J (WT) och de som är transgena knockouts för Lysophosphatidic Receptor 1 (LPAR1) (KO).
2. Innan vi börjar experimentet kommer vi att samla det material vi behöver för detta experiment. I vårt labb alla möss dissektioner utförs i ett laminärt flöde vävnadsodling huva speciellt om cellerna kommer att transplanteras till en mottagare djur istället för att användas för ex vivo analys. Vi börjar med att placera en blå plåt inne i huvan. Andra behövde föremålen inkluderar en pincett och en vass sax som har autoklaveras, en steril skalpell och spritsuddar. Vi kommer att behöva ändras PBS och en steril 6 brunnar, en mortel, toppad mortel, 50cc blå koniska röret och en 70uM engångsfilter.
3. Vi börjar med att ta en WT och en KO musen.
4. Dessa möss avlivas av CO ₂ inandning och sedan doppas i 70% isopropranolol i 5 sekunder. Detta steg förhindrar kontamination av cellerna av intresse med musen päls och i våra händer har inte lett till någon kompromiss i avkastning av celler eller experimentella resultat.
5. Mössen är sedan dissekeras i sin tur hjälp av en pincett och vassa saxar. Vi börjar oftast med WT musen som en fråga om rutin. En liten klipp görs i ventrala huden på musen överliggande buken och huden är sedan sträcks med hjälp av händerna. Huden lossnar från bakbenen lätt. Lårbenet och skenbenet är extraheras sedan noga med att inte rubba huvudet på lårbenet eftersom det innehåller en stor mängd benmärg. Händer och armar är fristående från djurets torso genom att helt enkelt tillämpa dragkraft till dem och samtidigt hålla överkroppen stilla. Detta tar bort de övre extremiteterna som en styck. Den överarmsben sedan ur de övre extremiteterna.
6. Den borttagna benen är placerade i modifierad PBS som har lagts till 6 bra plattor. Ändrad PBS görs genom att tillsätta 2 ml värmeinaktiverad fetalt bovinserum och 2 cc av EDTA 0,5 M pH8. Denna lösning filtreras sedan genom en Nalgene 0,45 um filter och kan förvaras i fyra grader i minst en månad.
7. Det är viktigt att märka brunnar i plattan för att kunna identifiera WT och KO ben på rätt sätt.
8. Musen slaktkroppar avlägsnas och omhändertas av.
9. Ett nytt blad läggs i huven och benen rengörs med en disponibel skalpell.
10. De rengjorda ben placeras en mus i taget i morteln. Två ml modifierat PBS läggs till i mortel och benen krossas med en mortelstöt. Det är viktigt att första fragmentet benen med 10 fram och tillbaka rörelser mortel och sedan pulverisera dem med rund roterande rörelser. Jag brukar 50 medurs, sedan 50 moturs rörelser och så vidare tills material kvar i morteln är vit till färgen och den modifierade PBS läggs till materialet förblir vita eller genomskinliga.
11. Efter varje uppsättning av 50 cirkulära krossning rörelser, överför vi den vätska från murbruk till 70 um filter placerad på toppen av en 50 ml koniska rör. Glöm inte att lägga till 2 ml PBS i morteln efter varje överföring till filtret. Du vill inte försöka pulverisera torra ben och låt dem torka en längre tid eftersom detta kommer att leda till apoptos av celler.
12. När materialet i morteln blir vit, är materialet i filtret överfördes till murbruk och krossning är återigen utförs. Detta säkerställer att cellerna i filtret inte slösas bort. Vanligtvis tar det en eller två uppsättningar av cirkulära roterande rörelser för att återigen göra materialet i morteln vit färg vid vilken tidpunkt utvinningen av celler är klar.
13. Lösningen i den koniska röret är nu centrifugeras (kom ihåg att hålla celler från WT och KO musen separat. Därför kommer du att ha två olika rör (ett med WT celler, den andra med KO celler). Centrifugera vid 1200 rpm i 10 minuter.
14. Sug bort supernatanten med separata aspirator pipetter för varje rör. Tillsätt 2 cc av ACK lyseringsbuffert till varje pellet. Detta lyseringsbuffert bör vara sterila. Inkubera på is i 5 minuter.
15. Lägg till 8 cc av modifierade PBS till varje rör. Ta 10 ul från varje rör och pipettera i två separata brunnar i en 96 brunnar. Placera rören i centrifugen och snurra dem vid 1200 rpm i 10 minuter.
16. Medan rören spinning, tillsätt 30 ul av tryphan blå färg och 60 ul av modifierade PBS i varje brunn av de 96 brunnar som bär cellerna av intresse.
17. Tillsätt 10 ul av denna blandning (vänligen blanda väl genom att pipettera upp och ned) till ett hemocytometer och räkna cellerna i de fyra yttre rutorna.
18. De celler i varje prov per ml är antalet celler därmed räknas delat med 4 och multiplied med 100 000.
19. När centrifugeringen är klar, ta bort rören från centrifugen och återsuspendera cellerna i PBS utan kalcium, magnesium eller L glutamin vid en koncentration på 20 miljoner celler per ml. Du kommer troligen att ha ca 5 ml volym för WT och 5 ml volym för KO djur. Från detta steg framåt kommer vi att använda PBS, inte ändras PBS för protokollet.
20. Till varje rör lägga DII, en cellfärgning färg, för att uppnå en slutlig koncentration av 5uM. Vortexa omedelbart i 10 sekunder. Inkubera vid 37 grader i 10 minuter och undvika exponering för ljus.
21. Fyll rören med PBS och centrifugera i 10 minuter vid 1200 rpm.
22. Efter centrifugering, aspirera supernatanten och suspendera cellerna i PBS till 40 miljoner celler per ml.
23. Ladda 500 ul till 1 cc sprutor med en 27G nål (5 sprutor för WT musen och 5 sprutor för KO möss). Det kan vara klokt att förbereda sex sprutor för varje årskull. Med en extra kan hjälpa så svansvenen injektioner som vi ska göra härnäst kan vara knepigt.
24. Täck sprutor med folie för att hålla DII från sönderfallande.
25. Injicera 500 ul av cellen blandningen i varje mottagare djur, (5 för varje årskull).
26. Dessa djur måste bestrålas med 9 Gy av bestrålning 4-24 timmar före injektionen.
27. 48 timmar efter injektionen, skörd benmärg från bakbenen för varje mottagare djur.
28. Som beskrivs ovan för givarna. Resuspendera celler från varje djur i en cc PBS. Skaffa ett celltal med hjälp av en hemacytometer.
29. Läs på LSR II flödescytometern från BD eller motsvarande instrument. Resultatet kan uttryckas som procent eller absoluta antalet celler i det analyserade benmärgen som DII positiva.

Homing är den process där benmärgsceller, inklusive stamceller, celler stamceller och differentierade celler, sin väg in i benmärgen efter att injiceras i blodbanan eller benmärg hålighet av möss. Som framgår av den definitionen, kan en forskare valde att studera de målsökande av hematopoetiska stamceller, progenitorceller eller differentierade celler identifieras av immunfenotypning och isoleras genom cell sortering. Typiskt vetenskapsmän injicera benmärgsceller utarmat för härstamning markörer och därmed berikat för stamceller och stamceller.

Dosen av cellerna av intresse injiceras är en variabel i detta experiment. Antalet celler kan variera från 500 000 euro per mottagare mus till 20 miljoner per mottagare mus. Ju fler celler som man kan injicera lättare att upptäcka i benmärgen. Mobilnummer tillgänglighet kan begränsa antalet injiceras. Sortering 20 miljoner LKS SLAM celler är extremt svårt kanske opraktiskt med nuvarande teknik i de flesta laboratoriemiljö, i vilket fall man kan välja att använda ett antal celler mot den lägre delen av intervallet ovan.

Slangen djur vars målsökande studeras kan också variera. Den här mottagaren djuret kan vara en WT C57BL/6J mus som har dödligt bestrålas med 9 Grays av strålning som vi gjorde i detta experiment, en WT C57BL/6J mus eller ett W / Wv mus som inte har bestrålats. Om musen är bestrålat eller inte beror på den fråga försöksledaren försöker svara. Om man är intresserad av att studera returnera i en miljö där en stor mängd cytokiner släpps och vaskulär läcka är inducerad, är en bestrålad WT mus ett lämpligt val. Ett mindre antal celler (500 000) kan injiceras i en WT mus som inte har bestrålats så att stamceller kan hem till ett litet antal lediga nischer utan att ovanstående confounders.

W / Wv möss har brist på c-KIT receptorn funktion och kan ympas stamceller utan konditionering. Detta ger oss möjlighet att studera målsökande av stamceller i frånvaro av vaskulär skada eller cytokinfrisättning orsakas av strålning. Den logistiska problem med användandet av dessa möss är att det är svårt att få tillräckligt många wwv möss att fungera som mottagare beroende på storlek avel koloni oro.

I korthet, trots att vi beskriver en vanlig målsökande protokollet som användes variationerna beror på den fråga som skall besvaras och måste bestämmas under utformningen av experimentet.