Homing von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark

1. Wir beginnen die Homing Experiment durch Extrahieren von Zellen im Experiment verwendet werden. Aus diesem aktuellen Experiment, das wir wollen wissen, interessiert, wenn die Referenzfahrt der gesamte Knochenmark zu den Nischen in den langen Knochen des Empfängers Tieren unterscheidet sich für Knochenmark-Zellen aus WT Tieren wie C57BL/6J (WT) extrahiert und jene, die transgene sind Vorprägungen für Lysophosphatidsäure-Rezeptor 1 (LPAR1) (KO).
2. Bevor wir den Versuch starten, die wir sammeln die Materialien, die wir für dieses Experiment. In unserem Labor alle Maus-Sektionen sind in einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze trug vor allem, wenn die Zellen gehen, um in einen Empfänger Tier statt für ex-vivo-Analyse verwendet transplantiert werden. Wir beginnen damit, eine blaue Folie im Inneren der Kapuze. Andere Objekte benötigt eine Pinzette und eine scharfe Schere, die autoklaviert worden sind, eine sterile Einweg-Skalpell und Alkoholtupfer. Wir modifizierten PBS und eine sterile 6-Well Platte, ein Mörser müssen, gekrönt Stößel, 50cc blau konischen Rohr und einem 70um Einweg-Filter.
3. Wir beginnen mit der Einnahme von einer WT und einer KO-Maus.
4. Diese Mäuse werden durch CO _2-Inhalation getötet und dann tauchten in 70% für 5 Sekunden isopropranolol. Dieser Schritt verhindert die Kontamination der Zellen von Interesse mit der Maus Fell und in unseren Händen hat zu keinen Kompromiss in einer Ausbeute von Zellen oder experimentellen Ergebnissen geführt.
5. Die Mäuse werden dann wiederum mit Hilfe einer Pinzette und einer scharfen Schere durchtrennt. Wir arbeiten normalerweise mit dem WT-Maus als eine Frage der Routine zu starten. Ein kleiner Schnitt in der Bauchhaut der Maus über dem Bauch und die Haut wird dann gestreckt mit den Händen gemacht. Die Haut löst sich die Hinterbeine leicht. Die Ober-und Unterschenkels werden dann extrahiert dabei nicht auf den Kopf des Oberschenkelknochens zu verdrängen, da dies eine große Menge von Knochenmark. Die oberen Extremitäten sind aus dem Tier den Oberkörper durch die einfache Anwendung Traktion, um sie unter Beibehaltung der Torso immobile abgelöst. Dies entfernt die oberen Gliedmaßen in einem Stück. Die humeri werden dann von den oberen Gliedmaßen extrahiert.
6. Die entnommenen Knochen sind in modifizierter PBS gelegt, die auf 6-Well-Platten aufgenommen worden. Geändert PBS wird durch Zugabe von 2 ml hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 2 ccm der EDTA 0,5 M pH 8 hergestellt. Diese Lösung wird dann durch ein Nalgene 0,45 um-Filter filtriert und bei 4 Grad Celsius für mindestens einen Monat gelagert werden.
7. Es ist wichtig, in die Vertiefungen in der Platte Label, um in der Lage sein WT und KO Knochen korrekt zu identifizieren.
8. Die Maus Kadaver werden entfernt und entsorgt.
9. Ein neues Blatt in der Motorhaube platziert und die Knochen gereinigt werden mit einem Einweg-Skalpell.
10. Die gereinigten Knochen sind eine Maus in einer Zeit, in der Mörtel gelegt. Zwei ml modifizierter PBS ist es, den Mörtel hinzugefügt und die Knochen werden zerkleinert mit einem Stößel. Es ist wichtig, erste Fragment den Knochen mit 10 hin und her Bewegungen der Stößel und dann zu pulverisieren sie mit kreisenden Drehbewegungen. Ich in der Regel haben 50 im Uhrzeigersinn, dann 50 gegen den Uhrzeigersinn Bewegungen und so weiter, bis das Material in den Mörtel links ist in der Farbe weiß und dem modifizierten PBS hinzugefügt, um das Material bleibt weiß oder transparent.
11. Nach jedem Satz von 50 kreisförmigen Bewegungen Zerkleinerung, übertragen wir die Flüssigkeit aus dem Mörtel zu 70 uM Filter auf einem 50 ml konischen Röhrchen gegeben. Vergessen Sie nicht, bis 2 ml PBS, um den Mörtel add nach jeder Übertragung auf den Filter. Sie wollen nicht zu versuchen und zu pulverisieren trockenen Knochen oder lassen Sie sie trocknen für längere Zeit, wie diese zur Apoptose der Zellen führen.
12. Sobald das Material in den Mörtel wird weiß, wird das Material in den Filter, um den Mörtel verlegt und die Zerkleinerung wird erneut durchgeführt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Zellen in der Filter nicht verschwendet werden. Normalerweise dauert es ein oder zwei Sätze von kreisförmigen Drehbewegungen wieder das Material in den Mörser in der Farbe weiß, zu welchem ​​Zeitpunkt der Gewinnung der Zellen abgeschlossen ist.
13. Die Lösung in dem konischen Rohr wird nun zentrifugiert (bitte denken Sie daran, die Zellen aus dem WT-und KO-Maus getrennt zu halten. Daher werden Sie zwei verschiedene Rohre (eines mit WT-Zellen, die andere mit KO-Zellen). Zentrifugation bei 1200 rpm für 10 ausgewählte Minuten.
14. Absaugen des Überstandes mit separaten Aspirator Pipetten für jede Röhre. 2 ccm ACK-Lysepuffer zu jedem Pellet. Diese Lyse-Puffer sollte steril sein. Inkubieren auf Eis für 5 Minuten.
15. Add 8 cc modifizierter PBS in jedes Röhrchen. Nehmen Sie sich 10 ul aus jedem Röhrchen und Pipette in zwei getrennten Vertiefungen in einer 96-Well-Platte. Die Röhrchen in der Zentrifuge und Spin sie bei 1200 rpm für 10 Minuten.
16. Während die Rohre drehen, fügen Sie 30 ul tryphan blauen Farbstoff und 60 ul der modifizierten PBS in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die die Zellen von Interesse führt.
17. Add 10 ul dieser Mischung (bitte gut mischen durch Auf-und Abpipettieren), um eine Zählkammer und zählen Sie die Zellen in den vier äußeren Plätzen.
18. Die Zellzahl in jeder Probe pro ml ist die Anzahl der Zellen werden somit durch 4 und multiplie geteiltd von 100 000 Euro.
19. Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und die Zellen in PBS ohne Calcium, Magnesium oder L Glutamin in einer Konzentration von 20 Millionen Zellen pro ml. Sie werden wahrscheinlich etwa 5 ml Volumen für den WT und 5 ml Volumen für die KO Tier. Von diesem Schritt weiter werden wir mit PBS, nicht geändert PBS für das Protokoll.
20. Zu jedem Röhrchen hinzufügen DiI, ein Zellfärbung Farbstoff, zu erreichen in einer Endkonzentration von 5um. Vortex sofort für 10 Sekunden. Bei 37 Grad für 10 Minuten und zur Vermeidung von Lichteinstrahlung.
21. Füllen Sie das Röhrchen mit PBS und Spin für 10 Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute.
22. Nach der Zentrifugation absaugen Überstand und Zellen in PBS bei 40 Millionen Zellen pro ml.
23. Legen Sie 500 ul in 1-ml-Spritzen mit einer 27G Nadel (5 Spritzen für die WT-Maus und 5 Spritzen für die KO-Mäuse). Es kann sein, klug, 6 Spritzen für jede Kohorte vorzubereiten. Nachdem eine zusätzliche Hilfe können Sie wie Schwanzvene Injektionen, die wir als nächstes tun werden kann tückisch sein.
24. Decken Sie die Spritzen mit einer Folie, um die DiI von zerfallenden zu halten.
25. Inject 500 ul der Zelle Mischung in jeder Empfänger Tier; (5 für jede Kohorte).
26. Diese Tiere müssen mit 9 Gy Bestrahlung bestrahlt 4-24 Stunden vor der Injektion werden.
27. 48 Stunden nach der Injektion, Ernte Knochenmark aus dem hinteren Gliedmaßen des jeweiligen Empfängers Tier.
28. Verfahren wie oben für den Spender beschrieben. Resuspendieren der Zellen von jedem Tier in 1 ccm PBS. Besorgen Sie sich eine Zellzahl unter Verwendung eines Hämozytometers.
29. Lesen Sie auf der LSR II Durchflusszytometer von BD oder einem vergleichbaren Gerät. Das Ergebnis kann als Prozentsatz oder absolute Anzahl der Zellen in den analysierten Knochenmark, die DiI positiv ausgedrückt werden.

Homing ist der Prozess, durch Knochenmarkszellen wie Stammzellen, Vorläuferzellen und differenzierte Zellen, ihren Weg in das Knochenmark, nachdem sie in die Blutbahn oder Knochenmarkshöhle von Mäusen injiziert. Wie aus der Definition, kann ein Wissenschaftler wählten die Homing von hämatopoetischen Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierten Zellen durch Immunphänotypisierung identifiziert und isoliert durch Zellsortierung zu studieren. Typischerweise Wissenschaftler injizieren Knochenmarkzellen für Linie Marker aufgebraucht und somit für die Vorläuferzellen und Stammzellen angereichert.

Die Dosis der Zellen von Interesse injiziert wird eine Variable in diesem Experiment. Die Anzahl der Zellen können aus 500 000 pro Empfänger Maus auf 20 Millionen pro Empfänger Maus variieren. Je mehr Zellen kann man injizieren desto einfacher ist die Detektion im Knochenmark. Zellzahl Verfügbarkeit kann die Zahl injiziert. Sorting 20 Millionen LKS SLAM Zellen ist äußerst schwierig, vielleicht sogar unmöglich mit den aktuellen Technologien in den meisten Labors Einstellungen, in welchem ​​Fall man sich entscheiden, eine Reihe von Zellen in Richtung des unteren Endes der oben angegebenen Bereich verwenden können.

Der Schlauch Tieres, bei dem Homing untersucht wird, kann ebenfalls variiert werden. Dieser Empfänger kann ein Tier WT C57BL/6J Maus, die schon tödlich ist mit 9 Grays der Strahlung bestrahlt, wie wir in diesem Experiment wurde eine WT C57BL/6J Maus oder ein W / Wv Maus, die nicht bestrahlt wurde getan haben. Ob die Maus bestrahlt wird oder nicht, hängt die Frage der Experimentator versucht zu beantworten ist. Wenn man Interesse an einem Studium Homing in einem Umfeld, wo eine große Menge an Zytokinen freigesetzt wird und vaskuläre Leckage wird induziert wird, ist ein bestrahlten WT-Maus eine geeignete Wahl. Eine kleinere Anzahl von Zellen (500 000) kann in eine WT-Maus, die bisher nicht so, dass die Stammzellen nach Hause, um eine kleine Zahl von unbesetzten Nischen, ohne die oben Confounder bestrahlt injiziert werden.

W / Wv Mäuse weisen einen Mangel an c-KIT-Rezeptor-Funktion und kann einprägen Stammzellen ohne Vorkonditionierung. Dies erlaubt uns, die Homing von Stammzellen in der Abwesenheit von Gefäßverletzung oder Zytokinfreisetzung durch Strahlung zu studieren. Die logistische Problem bei der Verwendung dieser Mäuse ist, dass es schwierig ist, eine ausreichende Anzahl von WWV Mäusen als Empfänger aufgrund Brutkolonie Größe betrifft dienen zu erhalten.

Kurz gesagt, obwohl wir ein Standard-Homing-Protokoll zu beschreiben, verwendet die Variationen auf die Frage zu beantworten und muss bestimmt werden während der Konstruktion des Experimentes ab.