Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

1. Biz, deneyde kullanılmak üzere hücrelere açılan homing deney başlar. Alıcı hayvanların uzun kemiklerde nişler tüm kemik iliği homing WT C57BL/6J (WT) gibi hayvanlardan elde edilen kemik iliği hücreleri için farklı ve transgenik olanlar eğer bu deneme için biz bulmaya ilgilenen Lysophosphatidic Reseptör 1 (LPAR1) (KO) nakavt.
2. Deney başlamadan önce, bu deney için gerekli malzemeleri toplamak. Hücrelerin yerine ex-vivo analizi için kullanılan bir alıcı hayvan nakledilen olacak laboratuvar, özellikle tüm fare diseksiyonları bir laminer akış doku kültürü kaputu yürütülmektedir. Biz kaput içinde mavi bir levha koyarak başlar. Ihtiyaç duyulan diğer nesneleri forseps bir çift ve otoklavda sterilize edilmiş keskin bir makas, neşter ve alkol steril tek kullanımlık bezlerden içerir. Biz değiştirilmiş PBS ve steril bir 6 plaka, harç gerekecektir, havaneli şart, 50cc mavi konik tüp ve 70uM bir tek filtre tepesinde.
3. Biz bir WT ve bir KO fare alarak başlar.
4. Bu fareler, _CO 2 Solunduğunda ötenazi ve daha sonra 5 saniye boyunca% 70 isopropranolol batırılmış. Bu adım, kirlenmesini fare kürk ve bizim ellerimizde ilgi hücreleri, hücreler ya da deneysel sonuçlar verim herhangi bir uzlaşma değil önler.
5. Fareler daha sonra bir çift forseps ve keskin bir makas kullanarak sırayla disseke edilir. Biz genellikle rutin bir mesele olarak WT fare ile başlar. Küçük bir snip, karın ve deri daha sonra ellerini kullanarak gerilir üzerinde fare ventral deri yapılır. Cilt kolayca arka bacaklarda çıkıyor. Femur ve tibia sonra femur başı, bu büyük bir miktar kemik iliği içerdiğinden çıkarmak için özen ayıklanır. Üst ekstremitelerde, gövde hareketsiz tutarak sadece onlara çekiş uygulanarak hayvan gövde ayrıdır. Bu, tek parça olarak üst ekstremitelerde kaldırır. Humeri sonra üst ekstremitelerde ayıklanır.
6. Kaldırılan kemikler 6 kuyucuğu eklenmiş olan modifiye PBS yerleştirilir. Modifiye PBS ısı inaktive fetal Bovine Serum ve EDTA 0,5 M pH8 2 cc 2 ml ekleyerek yapılır. Bu çözüm daha sonra bir Nalgene 0.45 um filtre süzülür 4 santigrat derece sıcaklıkta ve en az bir ay süreyle saklanabilir.
7. WT ve KO kemikleri doğru tespit edebilmek için plakasını kuyuların etiketlemek için esastır.
8. Fare karkaslar kaldırılır ve bertaraf.
9. Yeni bir sayfa kaput yerleştirilir ve kemikler tek bir neşter kullanılarak temizlenir.
10. Temizlenmeli kemiklerin harcı bir süre tek bir fare yerleştirilir. İki ml modifiye PBS harç eklenir ve kemiklerin bir havaneli kullanarak ezilmiş. Sonra 10 ve havaneli fro hareketleri ve kemikleri dairesel dönme hareketleri ile onları ezebileceği ilk parça için önemli. Ben genellikle 50 saat yönünde, daha sonra 50 saat yönünün tersine hareketleri yapmak ve böylece havanda sol malzeme, renk ve modifiye PBS beyaz kadar beyaz veya şeffaf kalır malzeme eklendi.
11. 50 dairesel kırma hareketleri her ayarladıktan sonra, harç, 50 ml konik tüpün üstüne yerleştirilen 70 UM filtre sıvı transferi. Filtre Her aktarımdan sonra harç 2 ml PBS eklemek için ihmal etmeyin. Denemek ve bu hücrelerin apoptozis yol açacak gibi ezebileceği kuru kemiklerin veya uzun bir süre için onlara kuru ayrılmak istemiyorum.
12. Harç malzemesi beyaz olduktan sonra, filtre malzemesi harç transfer ve kırma tekrar yapılır. Bu filtre hücreleri israf edilmemesini sağlar. Genellikle hücre çıkarma, hangi zamanda harç beyaz renkli malzeme tekrar yapmak için bir veya iki adet dairesel dönme hareketleri alır.
13. Konik tüp çözüm (lütfen WT ve KO fare ayrı hücrelere tutmak için unutmayın. Dolayısıyla 1200 rpm'de 10 için iki farklı boru (KO hücreleri ile WT hücreleri bir diğer). Santrifüj olacak santrifüj dakika.
14. Her tüp için ayrı aspiratör pipetler kullanarak süpernatantı aspire. ACK lizis tamponu 2 cc her pelet ekleyin. Bu lizis tamponu steril olmalıdır. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
15. Her tüpe 8 cc modifiye PBS ekleyin. 96 plaka iki ayrı kuyu içine her tüpten 10 ul ve pipet alın. Santrifüj tüpleri yerleştirin ve 10 dakika 1200 rpm'de onları döndürün.
16. Tüpler iplik olmasına rağmen, ilgi hücreleri taşıyan 96 plaka her kuyuya tryphan mavisi 30 ul ve modifiye PBS 60 ul ekleyin.
17. Bir hemasitometre ekleyin ve bu karışımı 10 ul (yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın lütfen) dört dış kare hücreleri saymak.
18. Ml başına her örnek hücre sayımı, 4 ve multiplie bölünmüş böylece sayılır hücrelerinin sayısı100 000 d.
19. Santrifüj tamamlandıktan sonra, santrifüj tüpleri kaldırmak ve ml'de 20 milyon hücre bir konsantrasyonda kalsiyum, magnezyum veya L glutamin olmadan PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Büyük olasılıkla, KO hayvan için WT ve 5 ml hacim hacmi yaklaşık 5 ml olacak. Biz bu adımı itibaren protokol PBS değişmiyor PBS kullanarak olacak.
20. Her tüp eklemek DII, bir hücre boyama boya, 5uM son bir konsantrasyon elde etmek için. 10 saniye vorteksleyin. 37 derece 10 dakika inkübe edin ve ışığa maruz kalmasını önlemek.
21. Tüpler 1200 rpm'de 10 dakika süreyle PBS ve spin ile doldurun.
22. Santrifüj sonra, süpernatant aspirat ve ml'de 40 milyon hücre PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
23. 27G iğne (WT fare ve KO fareler için 5 şırınga için 5 şırınga) ile 1 cc şırınga içine 500 ul yükleyin. Her kohort için 6 şırınga hazırlamak için ihtiyatlı olabilir. Önümüzdeki yapacağız kuyruk ven enjeksiyonları yanıltıcı olabilir gibi ekstra bir tane yardımcı olabilir.
24. Dağılmakta DII tutmak için şırınga folyo ile örtün.
25. 500 ul her bir alıcı hayvan hücresi karışımı enjekte edilir (her kohort için 5).
26. Bu hayvanlar, enjeksiyon için 4-24 saat önce 9 Gy ışınlama ile ışınlanmış olması gerekir.
27. Enjeksiyon sonrası 48 saat, her alıcı hayvanın arka bacaklarda hasat kemik iliği.
28. Bağışçılar için yukarıda açıklandığı gibi işleyin. PBS 1 cc her hayvan hücreleri tekrar Hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı alın.
29. BD gelen LSR II akış sitometresi veya eşdeğer bir enstrüman okuyun. Sonuç DII pozitif analiz kemik iliği hücrelerinin yüzdesi ya da mutlak sayısı olarak ifade edilebilir.

Homing süreci bu sayede kemik iliği hücreleri kök hücreleri, progenitör hücreler ve farklı hücreler, kan akışı veya farelerde kemik iliği boşluğuna enjekte edildikten sonra kemik iliği onların yol içine dahil. Tanımı açık olarak, bir bilim adamı, hematopoietik kök hücre, progenitör hücreler ya da hücre sıralayarak izole işaretleyicidir tarafından belirlenen ve farklılaşmış hücrelerin homing çalışma seçebilirler. Tipik olarak, bilim adamları, soy belirteçler için tükenmiş kemik iliği hücreleri enjekte ve dolayısıyla progenitör ve kök hücre için zenginleştirilmiş.

Bu deneyde bir değişken faiz enjekte edilen hücrelerin doz. Hücre sayısı 500 000 alıcı fare başına ortalama 20 milyon alıcı fare değişebilir. Daha fazla hücre, bir kemik iliği tespiti daha kolay enjekte edebilir. Hücre sayısı kullanılabilirliğini enjekte sayısını sınırlamak. 20 milyon LKS SLAM hücreleri Sıralama bile pratik bir hücre, yukarıda verilen aralığın alt sonuna doğru numarayı kullanmak için karar verebilir, bu durumda, en laboratuvar güncel teknolojileri, belki de çok zor.

Çalışılmaktadır homing hangi hortum hayvan da çeşitli olabilir. Bu alıcı hayvan, biz bu deney, bir WT C57BL/6J fare veya ışınlanmış W / Wv fare gibi ölümcül radyasyon 9 Grays ile ışınlanmış WT C57BL/6J fare olabilir. Fare ışınlanmış veya deneyci cevap çalışıyor soru bağlıdır olup olmadığını. Bir sitokinlerin büyük miktarda piyasaya sürülüyor ve vasküler sızıntı neden olan bir ortamda homing eğitim ilgi ise, ışınlanmış WT fare uygun bir seçimdir. Hücreleri (500 000) bir daha az sayıda, kök hücreler kimse nişler az sayıda ev yukarıdaki karışıklıklar olmadan ışınlanmış değil WT fare enjekte edilebilir.

W / Wv fareler c-KIT reseptör fonksiyon eksikliği ve herhangi bir önkoşullamanın olmadan kök hücre aşılamak. Bu bize kök hücrelerin radyasyon nedeniyle vasküler yaralanma veya sitokin salınımı yokluğunda homing çalışma sağlar. Bu farelerin kullanımı ile lojistik sorunu WWv farelerin yeterli sayıda üreyen koloni boyutu endişeleri nedeniyle alıcıların olarak hizmet elde etmek zordur.

Kısacası, biz standart bir homing protokol tarif olmasına rağmen, deney tasarımı sırasında cevaplanması gereken ve kararlı olmalıdır sorusu üzerine varyasyonlar bağlı kullanılır.