Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

Parte 1: La interrupción de la Influenza A virión

1. Añadir 750 l de tampón SM (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) en un tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) diseñado para encajar en un rotor TLA-120.2 para su uso en un Beckman Optima Max-E ultracentrífuga.
2. Añadir 500 l de la gripe A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 cepa, 2 mg / ml) en ese tubo. Mezcla del virus con el buffer de MNT pipeteando arriba y abajo varias veces.
3. Centrifugar durante 10 minutos a 109.000 xg, 4 º C, en un Beckman Optima Max-E centrífuga con un rotor TLA-120.2.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 buffer interrupción l (100 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 5% (w / v) de glicerol, 50 mM octilglucósido, 10 mg / ml lisolecitina, 1,5 mM de ditiotreitol 100 mM MES, pH 5,5).
5. Agitar vigorosamente, y se agita a 31 ° C durante 20 minutos en un termomezclador eppendorf.

Parte 2: gradiente de glicerol sedimento centrifugado de velocidad

1. Preparar un gradiente de glicerol mediante la colocación de las siguientes cantidades de glicerol en un tubo de centrífuga Beckman ultraclaros (13 mm x 51 mm): 1 ml al 70% (v / v) de glicerol, 0,75 ml de glicerol al 50%, 0.375 ml de glicerol 40%, y 1,8 ml 33% de glicerol. Soluciones de glicerol se obtienen mezclando glicerina pura con tampón NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). También preparan un tubo que contiene tanto el equilibrio de glicerol y tampón.
2. Vortex la muestra viral interrumpe de nuevo, y cargarlo en el gradiente de glicerol.
3. Centrifugar el gradiente de 3,75 horas a 217.000 xg, 4 º C, en un Beckman MLS-50-Rotor oscilante.
4. Después de la centrifugación es completa, de forma manual recoger 250 alícuotas de la pendiente a partir de la parte superior del tubo. Mantenga las fracciones en hielo oa 4 º C.

Parte 3: Análisis de las fracciones de gradiente de glicerol por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

1. Retire 20 l de cada fracción a un tubo nuevo.
2. Añadir 5 l de tampón 5x muestra de SDS-PAGE.
3. Calor a 95 ° C durante 5 minutos.
4. Centrifugar las muestras de forma breve y cargarlos en un gel de poliacrilamida al 10%, e incluyen marcadores de peso molecular en uno de los pozos.
5. Ejecutar las muestras en el gel hasta que el colorante azul de bromofenol carga llega a cerca de la parte inferior del gel.
6. Tinción del gel con azul de Coomassie.

Parte 4: concentración de las fracciones vRNP

1. Elija las fracciones de glicerol que contiene principalmente NP, combinarlos, y los distribuyen en dos tubos de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm).
2. Llene cada tubo con dietil pirocarbonato (DEPC) tratados con agua ultrapura, y una pipeta de arriba a abajo varias veces para mezclar.
3. Centrifugar durante 4,5 horas a 157.000 xg, 4 º C, en un Beckman TLA-120.2 del rotor.
4. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 l de agua tratada con DEPC.
5. Si lo desea, el ₂₈₀ A de la vRNPs concentrado se puede medir. Como NP es el principal componente presente en las fracciones reunidas, una estimación de la molaridad de NP se puede calcular utilizando el coeficiente de extinción de 55350 M ^-1 cm ^-1 (según lo determinado por ProtParam ^3).
6. Alícuota del vRNPs purificada, y almacenarlas congeladas a -80 ° C para su uso posterior.

Parte 5: tinción negativa de vRNPs

1. Diluir 1 l de agua purificada vRNP en 9 l de recién hecho y se filtra el doble buffer MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Otros tampones también están bien para diluir el vRNPs y para lavar la red de la muestra (paso 5.5), pero no el uso de acetato de uranilo PBS si se utiliza para la tinción negativa.
2. Glow-descarga una muestra (TEM cobre) la red previamente recubierto de una película de carbono Parlodión y durante 30 segundos.
3. Sostenga el recién resplandor descargada la red muestra con pinzas, y aplicar una gota de 5 l de vRNP diluido en la cuadrícula de la muestra.
4. Salir de la gota de muestra en la parrilla durante 8 minutos.
5. Mientras espera, coloque una pequeña tira de Parafilm en el banco, y prescindir de dos gotas que contienen 10 l cada uno de tampón SM (para lavar la red), y una caída de 80 l de la solución de tinción recién hecho (1% molibdato de amonio o una % de acetato de uranilo) en el Parafilm.
6. Después de 8 minutos de adsorción, la mecha a una parte de la solución de la muestra de la red muestra con un pedazo de papel de filtro (cortado en triángulos). No permita que la red muestra que se seque.
7. Lave la red muestra en dos gotas que contienen 10 l cada uno de búfer SM por un tiempo total de 1 minuto. Esto se hace con cuidado bajar de la red de la muestra en la caída, y luego absorción de parte de la solución de la muestra de la red muestra con un pedazo de papel de filtro (sin dejar que la red de muestra seca).
8. Inmediatamente después de la absorción de la última gota de buffer de la red muestra, completasumergir mente la muestra dentro de la red de la gota mancha y espere un minuto.
9. Completamente la mecha de la solución de tinción de la red muestra con un pedazo de papel de filtro.
10. Permitir la red muestra se seque al aire durante varios minutos antes de la observación en el microscopio electrónico de transmisión.

Parte 6: Resultados del representante:

Figura 1

Como la gripe A NP (~ 56 kDa) es la principal proteína en los complejos de ribonucleoproteína viral, la banda de NP en general es el más fuerte de banda en las fracciones que contiene el vRNPs (Figura 1). Además de NP, cada vRNP influenza también contiene una copia de un trimérica RNA polimerasa (pesos moleculares de kDa 82, 86 y 86.5) complejos. Estos pueden ser o no ser visible por tinción con Coomassie azul debido a su abundancia es baja comparada con la de NP. Las polimerasas, sin embargo, se puede detectar si en lugar de un azul Commassie mancha, una mancha de plata del gel se realiza. La influenza proteína de la matriz M1 (~ 28 kDa) debe ser mínimamente presente en las fracciones en las fracciones de proteína NP pico están presentes.

Figura 2

VRNPs negativamente manchado tal como puede verse en un microscopio electrónico de transmisión debe ceder vRNPs que se asemejan a las partículas en forma de barra con longitud variable que son aproximadamente 30 nm a 120 nm de longitud (Figura 2a). El NP oligoméricas está organizado como una cadena de moléculas de NP que se ve doblada en una estructura de doble hélice repetir, por lo que los bucles en ambos extremos de estas partículas en forma de barra a veces se puede ver (figura 2b).

La purificación de vRNPs se basa en el procedimiento descrito por Kemler et al. (1994). ¹ Nosotros y otros han utilizado también este protocolo para aislar vRNPs para estudiar su importación nuclear. ^2,4,5

Se recomienda el uso de RNasa libre de puntas y los tubos de la hora de manipular vRNPs debido a que el genoma viral se compone de ARN, y por lo tanto, se degrada fácilmente en la presencia de ARN. Además, todos los buffers deben hacerse en el agua que está libre de RNasa. El protocolo aquí descrito se realizó con una extracción ácida (por ejemplo, el pH del tampón de interrupción y el gradiente de glicerol es de 5,5). Del mismo modo, una extracción básica se pueden realizar (como se describe por Kemler et al. (1994) ¹⁾ mediante la sustitución de MES, pH 5,5 con Tris, pH 7,8.