Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Parte 1: L'interruzione della Influenza A Virion

1. Aggiungere 750 ml di tampone MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in una centrifuga Beckman tubo di policarbonato (11 mm x 34 mm) progettato per adattarsi in un TLA-120,2 rotore per l'uso in Optima Beckman Max-E ultracentrifuga.
2. Aggiungere 500 ml di virus influenzale A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 ceppo; 2 mg / ml) in quel tubo. Mescolare il virus con il tampone MNT pipettando su e giù parecchie volte.
3. Centrifugare per 10 minuti a 109.000 xg, 4 ° C, in una Optima Max Beckman-E centrifuga con un TLA-120,2 rotore.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer interruzione (100 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 5% (w / v) glicerolo, 50 octylglucoside mM, 10 mg / ml lisolecitina, 1,5 mM ditiotreitolo, 100 mM MES, pH 5,5).
5. Energicamente, e poi agitare a 31 ° C per 20 minuti in un Thermomixer eppendorf.

Parte 2: gradiente Glicerolo centrifugazione sedimenti Velocity

1. Preparazione di un gradiente di glicerolo inserendo i seguenti importi di glicerolo in una provetta per centrifuga Beckman UltraClear (13 mm x 51 mm): 1 ml 70% (v / v) glicerolo, 0,75 ml di glicerolo 50%, 0,375 ml di glicerolo al 40%, e 1,8 ml di glicerolo al 33%. Soluzioni di glicerolo sono fatto mescolando glicerina pura con tampone NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Anche preparare un tubo di equilibrio che contiene sia glicerolo e buffer.
2. Il vortice perturbato campione virale di nuovo, e caricarlo sul gradiente di glicerolo.
3. Centrifugare il gradiente di 3,75 ore a 217.000 xg, 4 ° C, in un MLS-50 Beckman-rotore oscillante.
4. Dopo la centrifugazione è completo, manualmente raccogliere 250 ml di aliquote del gradiente partendo dalla parte superiore del tubo. Tenere frazioni su ghiaccio o a 4 ° C.

Parte 3: Analisi delle frazioni del gradiente di glicerolo mediante elettroforesi su gel poliacrilammide SDS

1. Togliere 20 l di ogni frazione in una nuova provetta.
2. Aggiungere 5 ml di 5x SDS-PAGE tampone del campione.
3. Di calore a 95 ° C per 5 minuti.
4. Spin down dei campioni brevemente e caricarli su un gel di poliacrilammide al 10%, e comprendono i marcatori di peso molecolare in uno dei pozzi.
5. Eseguire gli esempi sul gel fino a quando il colorante blu bromofenolo di carico raggiunge vicino al fondo del gel.
6. Macchia il gel con Coomassie blu.

Parte 4: Concentrazione delle frazioni vRNP

1. Scegliere il glicerolo frazioni contenenti principalmente NP, li uniscono e li distribuiscono in due provette da centrifuga Beckman in policarbonato (11 mm x 34 mm).
2. Riempire ogni tubo con dietil pirocarbonato (DEPC) trattati con acqua ultrapura, e seminare su e giù parecchie volte per mescolare.
3. Centrifuga per 4,5 ore a 157.000 xg, 4 ° C, in un TLA-120,2 Beckman rotore.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 50 ml di DEPC trattati con acqua.
5. Se lo si desidera, la A ₂₈₀ del vRNPs concentrato può essere misurata. Come NP è il principale componente presente nelle frazioni in pool, una stima della molarità di NP può essere calcolata utilizzando il suo coefficiente di estinzione di 55.350 M ^-1 cm ^-1 (come determinato tramite ProtParam ^3).
6. Aliquota del vRNPs purificata, e conservarli congelati a -80 ° C per un uso successivo.

Parte 5: colorazione negativa di vRNPs

1. Diluire 1 ml di purificata vRNP in 9 ml di appena fatti due volte e filtrata-tampone MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Altri buffer sono OK per diluire il vRNPs e lavare la griglia del campione (punto 5.5), ma non usare PBS se acetato di uranile viene utilizzato per la colorazione negativa.
2. Glow-scarica un esemplare (TEM rame) griglia precedentemente rivestito con una pellicola di carbonio parlodion e per 30 secondi.
3. Tenere la luce appena dimessi griglia-campione con una pinzetta, e applicare un 5-microlitri goccia di vRNP diluito sulla griglia campione.
4. Lascia la goccia di campione sulla griglia per 8 minuti.
5. In attesa, inserire una piccola striscia di Parafilm in panchina, ed erogare 2 gocce ciascuno contenente 10 microlitri di tampone MNT (per lavare la griglia) e un 80-microlitri goccia della soluzione di colorazione appena fatto (1 molibdato di ammonio% o 1 % acetato di uranile) sul Parafilm.
6. Dopo l'8-minuti di adsorbimento, stoppino spento una parte della soluzione del campione dalla griglia campione con un pezzo di carta da filtro (tagliata in triangoli). Non lasciate che la griglia campione ad asciugare.
7. Lavare griglia campione in 2 gocce contenenti 10 microlitri di tampone MNT ciascuno per un tempo totale di 1 minuto. Questo viene fatto con attenzione abbassando la griglia campione sulla goccia, e poi wicking una parte della soluzione del campione dalla griglia campione con un pezzo di carta da filtro (senza lasciare che la griglia di campione secco).
8. Immediatamente dopo wicking fuori l'ultima goccia di tampone dalla rete campione, completoLy immergere la griglia del campione all'interno della goccia macchia e attendere 1 minuto.
9. Stoppino completamente fuori la soluzione macchia dalla griglia campione con un pezzo di carta da filtro.
10. Lasciare che la griglia di campione asciugare all'aria per qualche minuto prima osservazione al microscopio elettronico a trasmissione.

Parte 6: Risultati Rappresentante:

Figura 1

Come l'influenza A NP (~ 56 kDa) è la principale proteina trovato in complessi ribonucleoproteina virale, la band NP è generalmente il più forte gruppo nelle frazioni contenenti la vRNPs (Figura 1). Oltre a NP, ogni vRNP influenza contiene anche una copia di un RNA polimerasi trimeriche (peso molecolare di kDa 82, 86 e 86,5) complesse. Questi possono essere o non essere visibili dalla colorazione Coomassie blu perché la loro abbondanza è bassa rispetto a quella di NP. La polimerasi, invece, può essere rilevato se, invece di un azzurro Commassie macchia, una macchia d'argento del gel viene eseguita. L'influenza matrice proteica M1 (~ 28 kDa) dovrebbe essere minimamente presenti nelle frazioni in cui le frazioni proteiche picco NP sono presenti.

Figura 2

VRNPs negativamente macchiato come visualizzato sotto un microscopio elettronico a trasmissione dovrebbe produrre vRNPs che assomigliano a forma di bastoncello particelle con lunghezza variabile che sono circa 30 nm a 120 nm di lunghezza (Figura 2a). La NP oligomerici è organizzato come una catena di molecole NP che è ulteriormente piegato in una struttura a doppia elica ripetere, loop così su entrambi le estremità di queste particelle a forma di bastoncello a volte può essere visto (Figura 2b).

La purificazione di vRNPs si basa sulla procedura descritta da Kemler et al. (1994) ^1. Noi e gli altri hanno usato anche questo protocollo per isolare vRNPs di studiare la loro importazione nucleare. ^2,4,5

Si consiglia l'uso di RNasi-free suggerimenti e tubi durante la manipolazione vRNPs perché il genoma virale è costituito da RNA, e quindi facilmente degrada in presenza di RNA. Inoltre, tutti i buffer dovrebbe essere effettuato in acqua che è RNasi libero. Il protocollo qui descritto è stato eseguito con l'estrazione acidi (ad esempio, il pH del tampone disgregazione e il gradiente di glicerolo è di 5,5). Allo stesso modo, una estrazione di base può essere effettuata (come descritto da Kemler et al. (1994) ^1), sostituendo MES, pH 5.5 con Tris, pH 7.8.