Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

Deel 1: Verstoring van het Influenza A Virion

1. Voeg 750 ul van de MNT-buffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in een Beckman polycarbonaat centrifugebuis (11 mm x 34 mm), ontworpen om in een TLA-120.2 rotor geschikt voor gebruik in een Beekman Optima Max-E ultracentrifuge.
2. Voeg 500 ul van het influenza A virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in die buis. Meng het virus met de MNT buffer door en neer te pipetteren meerdere malen.
3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 109.000 xg, 4 ° C, in een Beekman Optima Max-E centrifuge met behulp van een TLA-120.2 rotor.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 ui verstoring buffer (100 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 5% (w / v) glycerol, 50 mM octylglucoside, 10 mg / ml lysolecithin, 1,5 mM dithiothreitol, 100 mM MES, pH 5,5).
5. Vortex krachtig, en dan schudden bij 31 ° C gedurende 20 minuten in een eppendorf Thermomixer.

Deel 2: Glycerol Verloop Sediment Velocity Centrifugeren

1. Bereid een glycerol gradiënt door het plaatsen van de volgende bedragen van glycerol in een Beekman UltraClear centrifugebuis (13 mm x 51 mm): 1 ml 70% (v / v) glycerol, 0,75 ml 50% glycerol, 0.375 ml 40% glycerol, en 1.8 ml 33% glycerol. Glycerol-oplossingen worden gemaakt door het mengen van pure glycerol met NM buffer (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Ook voorbereiden van een evenwicht buis die zowel glycerol en buffer.
2. Vortex de verstoorde virale monster weer, en het op de glycerol gradiënt te laden.
3. Centrifugeer de gradiënt voor 3.75 uur bij 217.000 xg, 4 ° C, in een Beekman MLS-50 swingende-bucket rotor.
4. Na het centrifugeren is voltooid, handmatig verzamelen van 250 ul aliquots van het verloop vanaf de bovenkant van de buis. Houden fracties op ijs of bij 4 ° C.

Deel 3: Analyse van de Glycerol Gradient Breuken door middel van SDS polyacrylamidegelelektroforese

1. Verwijder de 20 ui van elke fractie naar een nieuwe buis.
2. Voeg 5 ul van 5x SDS-PAGE sample buffer.
3. Verwarm tot 95 ° C gedurende 5 minuten.
4. Spin down de monsters kort en laden ze op een 10% polyacrylamide gel, en omvatten moleculair gewicht markers in een van de putten.
5. Voer de monsters op de gel tot de broomfenolblauw laden kleurstof bereikt dicht bij de bodem van de gel.
6. Vlekken op de gel met Coomassie blauw.

Deel 4: Concentratie van de vRNP Breuken

1. Kies de glycerol fracties die voornamelijk NP, combineren en verspreiden ze in twee Beckman polycarbonaat centrifuge buizen (11 mm x 34 mm).
2. Vul elke buis met diethyl pyrocarbonate (DEPC) behandeld Ultrazuiver water en pipet op en neer meerdere malen om te mengen.
3. Centrifugeer gedurende 4,5 uur bij 157.000 xg, 4 ° C, in een Beekman TLA-120.2 rotor.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 ul van DEPC-behandeld water.
5. Indien gewenst, kan de _A-280 van de geconcentreerde vRNPs worden gemeten. Als NP is de belangrijkste component aanwezig in de samengevoegde fracties, kan een schatting van de molariteit van NP worden berekend met behulp van de extinctiecoëfficiënt van 55.350 m ^-1 cm ^-1 (zoals bepaald via ProtParam ^3).
6. Aliquot het gezuiverde vRNPs, en bewaar ze ingevroren bij -80 ° C voor later gebruik.

Deel 5: Negatieve kleuring van vRNPs

1. Verdun 1 ui gezuiverd vRNP in 9 ui vers gemaakt en gefilterd: twee keer MNT buffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Andere buffers zijn ook op OK om de vRNPs verdunnen en met het model net (stap 5.5) wassen, maar geen gebruik maken van PBS als uranylacetaat wordt gebruikt voor negatieve kleuring.
2. Glow-ontlading een exemplaar (koper TEM) grid vooraf bedekt met een parlodion en carbon film voor 30 seconden.
3. Houd de vers glow-ontslagen exemplaar raster met een pincet, en breng een 5-ul druppel verdund vRNP op het monster grid.
4. Laat de druppel van het specimen op de grid voor 8 minuten.
5. Tijdens het wachten, plaats een smalle strook van Parafilm op de bank, en breng 2 druppels met 10 ul elk van MNT buffer (aan het net te wassen), en een 80-ul daling van de vers gemaakte kleuroplossing (1% ammoniummolybdaat of 1 % uranylacetaat) op de Parafilm.
6. Na de 8-minuten van adsorptie, pit een deel van de monsteroplossing van het monster net met een stuk filtreerpapier (gesneden in driehoeken). Laat niet het specimen rooster te drogen.
7. Wassen exemplaar rooster in 2 druppels met 10 ul elk van MNT buffer voor een totale tijd van 1 minuut. Dit wordt gedaan door het zorgvuldig het verlagen van het monster raster op de druppel, en dan wicking een deel van de monsteroplossing van het monster net met een stuk filtreerpapier (zonder dat het monster net droog).
8. Onmiddellijk na het wicking uit de laatste druppel buffer van monster grid, compleetly dompel het specimen netwerk binnen de vlek druppel en wacht 1 minuut.
9. Volledig wiek de vlek oplossing van het monster net met een stuk filtreerpapier.
10. Laat het monster net aan de lucht drogen gedurende enkele minuten voor observatie onder een transmissie-elektronenmicroscoop.

Deel 6: representatieve resultaten:

Figuur 1

Zoals influenza A NP (~ 56 kDa) is het belangrijkste eiwit in virale ribonucleoproteïne complexen, de NP band is over het algemeen de sterkste band in de fracties die de vRNPs (figuur 1). Naast de NP, elke griep vRNP bevat ook een kopie van een trimere RNA-polymerase (moleculaire gewichten van 82, 86 en 86.5 kDa) complex. Deze kunnen wel of niet zichtbaar zijn door Coomassie blauwe vlekken, omdat hun overvloed is laag in vergelijking met die van de NP. De polymerase kan echter worden gedetecteerd als, in plaats van een Commassie blauwe vlek, een zilveren vlek van de gel wordt uitgevoerd. Het influenza matrix eiwit M1 (~ 28 kDa) moet minimaal aanwezig zijn in de fracties, waar de NP-eiwit piek fracties aanwezig zijn.

Figuur 2

Negatief gekleurde vRNPs zoals gevisualiseerd in een transmissie elektronen microscopie moet opleveren vRNPs die lijken op staafvormige deeltjes met variabele lengte, die ongeveer 30 nm tot 120 nm in lengte (Figuur 2a). De oligomere NP is georganiseerd als een keten van NP moleculen die verder is gevouwen in een dubbele helix-structuur te herhalen, zodat lussen aan beide uiteinden van deze staafvormige deeltjes kan soms worden gezien (Figuur 2b).

De zuivering van vRNPs is gebaseerd op de procedure beschreven door Kemler et al.. (1994). ¹ Wij en anderen hebben ook gebruikt dit protocol om vRNPs isoleren om hun nucleaire import te bestuderen. ^2,4,5

Wij raden het gebruik van RNase-gratis tips en buizen voor het manipuleren van vRNPs omdat het virale genoom bestaat uit RNA, en dus breekt gemakkelijk in de aanwezigheid van RNA. Daarnaast moeten alle buffers worden gemaakt in water dat is RNase vrij. Het protocol hier beschreven werd uitgevoerd met een zure extractie (bijv. de pH van de verstoring buffer en de glycerol gradiënt is 5,5). Op dezelfde manier kan een basis-extractie worden uitgevoerd (zoals beschreven door Kemler et al.. (1994) ¹⁾ wordt vervangen door MES, pH 5,5 met Tris, pH 7,8.