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 JoVE General

ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

, ,

Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University College of Physicians and Surgeons

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Video Article Chapters

Cite this Article: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).

Abstract: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

Protocol: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

इससे पहले कि आप शुरू

  1. सभी संस्कृतियों 25 डिग्री सेल्सियस पर विकसित किया जाना चाहिए
  2. HL3.1 विच्छेदन बफर अग्रिम में तैयार किया जा सकता है. HL3.1 की एक 50 मिलीलीटर विभाज्य ले लो और यह बर्फ पर रखने.
  3. HL3.1 में ताजा Formaldehyde 3.5% की 15 मिलीलीटर तैयार. यह बर्फ पर रखें.

लारवल विच्छेदन

  1. HL3.1 ठंड विच्छेदन प्लेट पर एक बूंद रखो. यह सुखाने और यह आसान के साथ काम करने के लिए अचेत जानवर बनाने से पशु रखेंगे.
  2. लंबे संदंश का प्रयोग, एक भटक तीसरे instar लार्वा का चयन करें और यह HL3.1 के ड्रॉप में जगह.
  3. सबसे पहले, कम संदंश का उपयोग करने के लिए एक minutien पिन समझ . पीछे spiracles बीच पिन प्लेस. जानवर आमतौर पर पिन से दूर क्रॉल ही बाहर खींच और यह आसान के लिए आपको एक पिन जगह मुंह हुक निकट लार्वा के सिर में squarely बनाने की कोशिश करेंगे. जानवरों की लंबाई खींचो. यह आपकी मदद करेंगे आप काटने के दौरान प्राप्त कर सकते हैं उजागर शरीर दीवार की राशि को अधिकतम. नोट: यदि आप पहली बार के लिए सिर पिन चुनते हैं, जानवर पिन के आसपास अपने शरीर लपेटो या अपने शरीर के आगे और पीछे कोड़ा यह मुश्किल पिन बना सकता है. आप आमतौर पर HL3.1 हटाने और फिर से एक ताजा ठंड आश्चर्यजनक ड्रॉप जानवर डाल द्वारा इस का मुकाबला कर सकते हैं. कपटी वैज्ञानिक भी सिर्फ जानवर हड़पने कर सकते हैं और यह जगह में पकड़.
  4. का प्रयोग वसंत कैंची सिर्फ एक क्षैतिज लार्वा के पृष्ठीय तरफ पीछे पिन करने के लिए पूर्वकाल चीरा बनाते हैं. चीरा में कैंची की एक ब्लेड प्लेस और लार्वा के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत की ओर पृष्ठीय midline साथ एक ऊर्ध्वाधर कट कर. जानवर के व्याख्यान चबूतरा पर छोड़ दिया और सही पिन करने के लिए क्षैतिज चीरों बनाते हैं. नोट: समाप्त परिणाम rostrocaudal अक्ष के साथ लार्वा के पृष्ठीय पक्ष पर एक मैं की तरह दिखना चाहिए.
  5. अंगों निकालें. लार्वा पर HL3.1 के कई अतिरिक्त बूँदें डाल द्वारा शुरू करो. यह अंगों आप उन्हें हटाने के लिए और अधिक आसानी से की अनुमति शरीर से बाहर फ्लोट करने में सक्षम हो जाएगा. सबसे पहले, tracheal सिस्टम को हटा. दूसरा, संदंश का उपयोग करने के लिए अंगों के आराम ले लो और उन्हें हटाने के लिए.
  6. चरण 3 के दौरान आप एक छोड़ दिया और शरीर की दीवार में सही प्रालंब प्रालंब बनाया है. एक दक्षिणावर्त शरीर दीवार के दोनों क्षैतिज और खड़ी खिंचाव सुनिश्चित करने के क्रम में फ्लैप पिन.

फिक्सेशन

HL3.1 में 25 मिनट के लिए 3.5% formaldehyde में प्रत्येक जानवर को ठीक करें. जानवर 5 मिनट के लिए HL3.1 में दो बार धोएं.

भंडारण

पिन निकालें और एक 1.5 मिलीलीटर 1X पीबीएस युक्त ट्यूब लार्वा हस्तांतरण. यदि आप इनकार फ्लोरोसेंट टैग का उपयोग कर NMJ की छवि के लिए योजना, तुम दो दिनों के भीतर पशुओं छवि चाहिए. आप dissected के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लार्वा की दुकान सकता है एक सप्ताह के लिए

प्रतिनिधि परिणाम

वहाँ एक ठीक से dissected ड्रोसोफिला लार्वा के लिए कई महत्वपूर्ण घटक हैं . सबसे पहले, एक अतिरिक्त देखभाल करने के लिए मांसपेशियों, विशेष रूप से मांसपेशियों 4, 6, और 7 नुकसान नहीं चाहिए. इन सबसे लोकप्रिय मांसपेशियों को अध्ययन कर रहे हैं और अगर वे क्षतिग्रस्त हो रहे हैं पट्टिका प्रस्तुत करने त्यागें और एक जानवर काटना. दूसरा, एक यकीन है कि जानवरों की ज़्यादा से ज़्यादा इतना फैला है कि प्रत्येक मांसपेशी और NMJ प्रतिष्ठित किया जा सकता करना चाहिए.

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Discussion: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

विच्छेदन इस वीडियो में प्रदर्शन तकनीक प्रयोगात्मक तकनीकों की एक किस्म के लिए ड्रोसोफिला लार्वा तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग मौजूद हैं, लार्वा और रखा जा सकता है तुरंत imaged. अन्यथा, immunostaining क्रम में विशिष्ट synaptic डिब्बों निशान किया जा सकता है है. इसके अलावा, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आसानी से dissected लार्वा पर प्रदर्शन किया जा सकता है neurotransmission के कामकाज का मूल्यांकन.

ड्रोसोफिला के NMJ प्रारंभिक अध्ययन है कि अपनी बुनियादी संरचना और समारोह के प्रबुद्ध के बाद से महान लोकप्रियता प्राप्त की है 1-4 अणुओं है कि ड्रोसोफिला NMJ के विकास के अध्ययन में पहचान की गई है के कई रीढ़ में संरक्षित कर रहे हैं. 4 इसलिए, के कई ड्रोसोफिला NMJ के अध्ययन के माध्यम से सीखा अंतर्दृष्टि सभी जीवित प्राणियों में synaptic जीव विज्ञान के लिए लागू होते हैं . कुछ संभव अनुप्रयोगों के अणुओं का अध्ययन अक्षतंतु मार्गदर्शन में शामिल है, मोटर न्यूरॉन रोग, सीखने, और स्मृति में शामिल हैं.

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Disclosures: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

Materials: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33 Long forceps
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Short forceps
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 Used to make dissection plates
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549-25ML
Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter Fine Science Tools 26002-10
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.


Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

References: ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन

  1. Jan L.Y. & Jan Y.N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M.E., Johansen, K.M. & Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci.9, 710-25 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A. & Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D.V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R. & Goodman, C.S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73,1137-53 (1993).
  5. Feng et al. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet (2004) vol. 18 (2) pp. 377-402 http://eutils.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&id=15763995&retmode=ref&cmd=prlinks

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2 Comments

Hi. I wonder if the fixation using formaldehyde is fine for any ulterior immunohistochemistry assay. Have you any experience if there is necessities for performing the fixation with other fixative? I´m asking this regarding the preservation of cytoskeletal proteins

1

Reply

Posted by: Javier AmbrosioFebruary 13, 2009, 4:07 PM

Very well done Mr. Brent. You have a have steady hand !

 

 

3

Reply

Posted by: Nicholas J Kenney PhDMarch 17, 2009, 10:47 AM

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