Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Parte 1: Preparação de micropipetas, e placas de câmara de microinjeção

1. Fabricar micropipetas por aquecimento e puxar os tubos de vidro de borosilicato capilar (Precision Mundial Instruments, Inc., 1B100-4) em um dispositivo extrator micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Armazenar em uma placa de Petri em cima de pequena quantidade de barro ou fita adesiva.
2. Despeje de agarose 1,5% (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) em placas 1x médio E3 moldado com depressões em forma de cunha que servirá como um método fácil para segurar os embriões durante a injeção (conforme descrito em "O Livro dos Zebrafish") ^1. Deixe placas câmara de ágar solidificar antes de usar e armazenar a 4 º C.

Parte 2: Preparação do RNA

Uma abordagem poderosa para estudos de função do gene é transcrito microinject in vitro RNA tampado em embriões de peixe-zebra. RNA tampado se comporta de forma semelhante ao mRNAs eucarióticos encontrados in vivo devido à presença da analógica CAP. Pesquisadores zebrafish rotineiramente utilizam este método para superexpressão ou misexpress seu gene de interesse. Nesta demonstração, iremos microinject uma transcrição EGFP-marcados e uso ao vivo todo embrião-GFP-expressão como uma leitura visível para uma injeção de sucesso.

1. Realizar uma reação de transcrição in vitro CAP RNA em sua transcrição de interesse. Em nosso laboratório, nós rotineiramente inserir um cDNA de interesse em um vetor + pCS2 e executar uma reação de síntese in vitro de grandes quantidades de RNA capped usando o mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340).
2. Purificar a amostra de RNA, executando-o através do kit Mini RNeasy (Qiagen, Inc., 74104) ou pelo fenol: clorofórmio e precipitação extração de isopropanol.
3. Cuidadosamente determinar a concentração de RNA a preparação e armazenar a -80 º C até que esteja pronto para uso.
4. No dia da injeção, descongelar a amostra de RNA vórtice, de ânimo leve e spin down brevemente.
5. Prepare uma solução de trabalho com água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Vermelho de fenol serve como um marcador visível para a injeção da solução para o embrião. Neste artigo, vamos preparar uma solução de trabalho de 100 mRNA EGFP ng / uL com 0,050% de vermelho de fenol.
6. Manter amostra de trabalho sobre o gelo e ações retorno RNA a -80 ° C.
7. Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra.

Parte 3: Preparação de morfolino

Oligonucleotídeos antisense morfolino são amplamente utilizados para modificar a expressão gênica, bloqueando tradução de uma proteína-alvo ou modificando pré-mRNA splicing ^2,3. Morpholinos no zebrafish servir como uma ferramenta poderosa de genética reversa por derrubar a função do gene. Neste artigo, vamos microinject um oligo morfolino voltado para o sítio de iniciação de translação de PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Baseado no trabalho previamente estabelecido, esperamos que os embriões injetados para fenotipicamente imitar PKD2 ⁴ peixes mutantes.

1. Rotineiramente ordem 300 nmol de um oligo morfolino projetado especificamente para um gene de interesse a partir de Ferramentas Gene, LLC (Philomath, OR).
2. Adicione 100 uL de água estéril para fazer uma solução estoque 3 mM. Solução de alíquotas e armazenar a -20 ° C até que esteja pronto para uso.
3. No dia da injeção, aquecer a solução morfolino a 65 ° C por 5 minutos. Pressão legal sobre o gelo imediatamente e girar rapidamente. Esta etapa desnatura qualquer estruturas secundárias na oligo e garante que a solução é completamente solubilizado.
4. Prepare uma solução de trabalho, diluindo a solução morfolino em água estéril e uma concentração final de 0,025 - 0,050% de vermelho de fenol. Nesta demonstração, iremos preparar uma solução de trabalho de 0,50 mM PKD2 morfolino com 0,050% de vermelho de fenol.
5. Continuar trabalhando solução à temperatura ambiente.
6. Prosseguir para a Parte 4, quando prontos para injetar essa amostra .----

Parte 4: Preencher o micropipeta com sua solução de trabalho

1. Corte a extremidade distal de uma micropipeta com uma pinça ou uma lâmina de barbear cirúrgico para criar uma abertura que é apenas visível sob um microscópio de dissecação (Nikon Instruments, Inc., SM2645) com ampliação de 50X.
2. Coloque 2 uL de sua solução de trabalho como uma gota em uma lamela.
3. Anexar a parte traseira de uma micropipeta para uma seringa de 5 mL equipado com tubos em uma agulha hipodérmica e ligeiramente submergir a ponta distal da micropipeta em sua gota de solução de trabalho. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta.
4. Sifão da solução de trabalho através da extremidade distal do micropipeta puxando o êmbolo da seringa.

Parte 5: Calibrando o volume de injeção micropipeta

1. Coloque uma gota de óleo mineral (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) em um micrómetro (Fisher, 12-561-SM1).
2. Ligue a alimentação e suprimento de ar para a pressão de pulso micro injector aparelho (World Precision Instruments Inc., PV830).
3. Anexar a micropipeta ao titular micropipeta do aparelho injector micro. O injetor de micro é pressão regulada e descargas são ativados pressionando o pedal.
4. Sob o microscópio de dissecção, teste o volume de injeção usando o injector micro para colocar uma gota de sua solução de trabalho para o óleo micrômetro. Medir o diâmetro da gota, enquanto flutua como uma esfera em cima do petróleo.
5. Ajustar a duração ea pressão de injeção de calibrar cuidadosamente o seu volume de injeção. Este passo ajuda na reprodutibilidade do experimento microinjeção. Nesta demonstração, todas as microinjeções será feito com um diâmetro queda de 0,15 mm (cerca de 1,76 nL em volume).
6. Uma vez que seu volume de injeção foi calibrado, utilize o "Hold" botão no injector micro para evitar vazamento e enchimento da micropipeta.

Parte 6: Preparando embriões fertilizados zebrafish para microinjeção

1. Zebrafish aleatoriamente mate em primeiras horas de cada manhã. Coletar embriões no estágio 1-célula e colocá-los em 1x médio E3.
2. Usando uma pipeta de transferência de 3 mL (Becton Dickinson para laboratórios, 357.524), organizar os embriões ao longo das calhas em forma de cunha na câmara de placas de microinjeção.
3. Remova a mídia de modo que os embriões são superficialmente submersos e não inundadas. Este passo ajuda na resolução dos embriões para o fundo dos vales, bem como na penetração do córion pela micropipeta.

Parte 7: microinjeção através do córion

1. Manipular os embriões com a micropipeta, para que o citoplasma do embrião estágio 1-célula é visível ao microscópio de dissecação. Tome cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta.
2. Penetrar no córion e depois a gema com a micropipeta, a fim de injetar o embrião. Nesta demonstração, que será o primeiro microinjecting na gema diretamente abaixo da célula, e permitir o fluxo citoplasmático e difusão para trazer a solução de trabalho na célula. Este fluxo é visível devido ao vermelho de fenol adicionado à solução de trabalho.
3. Vamos também demonstrar injecção directa no citoplasma da célula. Microinjeção direta na célula é mais robusto, mas demorada como a orientação adequada do embrião e da técnica de microinjeção é necessária. Como a membrana celular é mais rigoroso que a membrana da gema, muitas vezes é mais rápido para entrar na micropipeta através da gema para alcançar o citoplasma da célula. Orientar o pólo animal para o fundo do poço e trabalhar com as mãos firmes podem ajudar a este método de injeção.
4. Após a microinjeção, os embriões lugar em uma placa de Petri com meio de E3 e incube-os em 28,5 ° C para o desenvolvimento normal.
5. Mais próximas horas e dias de desenvolvimento embrionário, observe os embriões para o seu fenótipos de interesse.

Parte 8: Resultados Representante

EGFP superexpressão mRNA: Para verificar o sucesso da microinjeção, vamos monitorar a expressão da GFP em embriões em desenvolvimento no início escudo estágio (~ 6 hpf) por microscopia de fluorescência em todo embrião vivo (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expressão da construção é mais forte durante os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário e, muitas vezes, diminui durante o desenvolvimento como o RNA injetado capped é gradualmente degradada e depende da estabilidade da proteína expressa.

PKD2 translacional-blocking morfolino: Com base nos resultados publicados anteriormente, esperamos que a PKD2 morphants para imitar a curvatura do eixo dorsal do corpo como os encontrados no peixe-zebra PKD2 mutante e cistos renais presentes em cerca de 2-3 dpf ^4.

Figura 1: resultados Representante da microinjeção de EGFP mRNA e agosto PKD2 morfolino. (A) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com 0,17 ng de mRNA EGFP e visualizados em um dpf para in vivo expressão GFP. (B, c) embriões TAB receberam microinjeções na fase 1-célula com ~ 1,7 nl de um PKD2 translacional morfolino bloqueio de 0,50 mM e marcou para a curvatura do corpo dorsal, 4 dpf.

Microinjeção em embriões de peixe-zebra é uma técnica bem estabelecida e robusta para explorar o papel de um gene em particular no desenvolvimento. As aplicações incluem superexpressão, misexpression e ensaios knockdown do seu gene de interesse, bem como análise epistáticas entre genes múltiplos. Microinjeção em peixes-zebra tem sido amplamente utilizada para a geração de animais transgênicos, células e mapeamento de destino no início de embriões blástula ^5,6,7,8,9. Além disso, a aplicação desta técnica serve como um passo fundamental na geração de linha germinal quimeras por métodos transplante de células ^10.

Um método alternativo para explorar fenótipo de um gene "ganho de função" é microinject formas constitutivamente ativa desse gene. Além disso, "perda de função" pseudo fenótipo de um gene pode ser explorado por microinjeção de formas negativas dominante desse gene. Microinjeção em embriões de peixe-zebra também pode incluir DNA e pequenas moléculas ^11,12.

Um passo fundamental nesta técnica de microinjeção é a qualidade da agulha micropipeta. Nós fazemos nossa micropipeta de tubos capilares em forma por um dispositivo extrator pipeta. É essencial que o extrator pipeta está devidamente calibrado para render melhor forma de agulha e tamanho. Micropipetas que são demasiado longas e estreitas, muitas vezes a falta de rigidez, quebrar facilmente e luta para penetrar no córion e gema. Micropipetas curtas são muitas vezes mais propensos a danificar o embrião durante a microinjeção.