Engelberth, M. J., Engelberth, J. Monitoring Plant Hormones During Stress Responses. J. Vis. Exp. (28), e1127, doi:10.3791/1127 (2009).
植物ホルモンと関連するシグナリング化合物は、種々の環境刺激やストレスに対する植物の応答の調節に重要な役割を果たす。最も深刻なストレスの中で昆虫草食、病原体感染、および乾燥ストレスがあります。これらのそれぞれについて、その特定のホルモンのセットおよび/またはそれらの組み合わせを強調することにより、植物の生存を確保する、微調整応答することが知られています。これらの応答の調節に関与する主要なホルモンは、ジャスモン酸（JA）、サリチル酸（SA）、およびアブシジン酸（ABA）です。より個々のホルモンの役割だけでなく、これらの応答の間に彼らの潜在的な相互作用を理解するには、空間的な形でだけでなく、時間的にそれらの存在量の変化を監視する必要があります。これらおよび他のシグナリング化合物の、簡単で、感度が高く、再現性の定量化のために我々は気相抽出とガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析（1、2、3、4）に基づく方法を開発した。酸性水溶液、1 - プロパノールによる植物組織からこれらの化合物を抽出した後、ジクロロメタンと混合カルボン酸含有化合物は、メチル化熱で揮発し、高分子吸収剤で収集されます。サンプルバイアルに溶出後の検体は、ガスクロマトグラフィーによって分離され、化学イオン化質量分析法で検出。適切な内部標準の使用は、分析対象物と内部標準のピーク面積を関連付けることによって、単純な定量が可能になります。
まず、抽出のために2ミリリットルのスクリューキャップ付きバイアルを準備する必要があります：400ul抽出バッファーを加え（1 - プロパノール：H2O：濃塩酸2:1:0.002体積/体積/体積）とそれぞれの内部標準の10μlのは（10ng/μl ）バイアルに。液体窒素で凍結し、セラミックビーズを追加。 バイアルがまだ液体窒素内に位置している間（50〜200mgの間）植物材料を追加します。追加された植物材料の重量は、生体重に基づいて正確な定量化、のために後で可能にするためにさらに処理する前に推定する必要があることに注意してください。 すべての液体窒素がしっかりとキャップでバイアルを閉じる前に蒸発されていることを確認します。溶剤の流出を防ぐためにキャップがゴム製のシールを持っている必要があることに注意して、したがって、均質化中に化合物を抽出した。 30秒のための6000の速度（Precellys用）でFastPrepまたはPrecellysビードのグラインダーのホモジナイザーで組織をホモジナイズ。 個別にホモジナイザーからバイアルを取り外し、慎重にキャップを開き、各試料にジクロロメタンの1mlを加える。しっかりと再びバイアルを閉じて、6000（Precellys）で10 - 15秒のために再度ホモジナイズする。 卓上型遠心機にバイアルに移し、60秒のための10.000xgで水相から有機相を分離。 相分離の後にクリーンな4ミリリットルガラスバイアルに、個々のバイアルから下の緑色の層（有機相、ホルモンおよび内部標準を含む）を転送する。水（上相）の転送を避ける。また、酢酸エチル、ジクロロメタンの代わりに使用できます。その場合、ethyacetateフェーズでは、上位層（緑色）になると、今削除して、新鮮な4ミリリットルガラスバイアルに移し方が簡単ですでしょう。前と同様に、水の移動を避ける。 10月25日分程度（サンプルに依存）のためのマニホールドを通して空気と溶剤を吹き飛ばす、サンプルが乾燥している場合（慎重に）単一の気流の先端に確認してください。これは化合物の損失を引き起こす可能性のための過乾燥するサンプルは、しないでください。 サンプルは乾燥されると我々は、カルボン酸含有我々のサンプル中の化合物のメチル化を開始できます。最初に、diethyether /メタノール混合物（9:1 vol / vol）の100μlの2Mトリメチルシリルジアゾメタン溶液（ヘキサン、シグマアルドリッチで）の4μlに続く各バイアルに添加されています。バイアルは直ちにテフロンライニングシリコンセプタムを装備したオープントップスクリューキャップで閉じられます。穏やかに振盪し、25〜30分間室温でインキュベートする。 手順9を終えた後、目的のコレクションの温度で加熱ブロックとセットの電源を入れます。メチル化化合物の揮発性は、その大きさではなく、= O、- OH、及び- NHのような他の、より多くの極性基に依存する。ジャスモン酸とサリチル酸のメチルエステルのコレクションの温度に対して約80 ° Cで十分である、一方、例えば、C18脂肪酸のような他の化合物、ジャスモン酸 - アミノ酸複合体、コロナチン、および12 - オキソ- phytodienoic酸メチルエステルの間の温度を必要とする180から200 ° Cを効果的に揮発する。 30分インキュベーションした後にメチル化反応は、不要な副反応を避けるために停止する必要があります。これは、各バイアルに2M酢酸-溶液（ヘキサン中）4μlを加えることにより行われます。キャップと短いボルテックスでバイアルを閉じた後、サンプルは別の30分間インキュベートされている。 この気相抽出に使用されるフィルタは、ハンドメイドと表示されるフォームで市販されていない。彼らは、片側から約4cm長さのよくフィットガラス管が挿入されている外側のテフロンチューブ（7〜8センチメートル長い約）、で構成されています。それは内側のガラス管に到達するまでテフロンチューブの反対側にステンレスメッシュディスクは、管の内部に押されていることへの約20 - 30mgの吸着剤（SuperQ 100分の80（販売終了）またはHayeSep ® Q80/100のどちらか）追加されます。別のステンレス鋼のメッシュディスクが挿入され、最終的にガラスチップは、それによって慎重に吸収剤でステンレスメッシュディスクを押して、テフロンチューブにプッシュされています。詳細な画像フィルタを図1に示されています。 図1。 ステップ11のインキュベーション時間の間に、このようにメチル化し、揮発性の植物ホルモンのコレクションのためのフィルタは、200ulのジクロロメタン各2回洗浄後、メタノールの最初の200ulを使用して洗浄する必要があります、と。フィルタ内の残りの溶剤を空気で吹き飛ばします。フィルタは、今気相抽出を通じて揮発性ホルモンの捕捉に使用することができます。 インキュベーションの30分後に4ミリリットルバイアルキャップのラバーセプタムをメスでカットされます。気相抽出によって植物ホルモンを収集するにはクリーニングフィルターは約800ml/minの流量で、個々の真空ラインに接続されています。次に、フィルターをカットセプタムバイアルに挿入されます。小さなピペットチップは、空気入口として機能するように挿入されます。この手順の最初の部分の間に挿入されたフィルタを使用したバイアルは、保持する必要がその後、フィルタともGC / MSを汚染するフィルターチップ、と接触して得るためにバイアル内の液体のいずれかを避けるために、直立位置。すべての液体がフィルターを介して蒸発するまで、バイアルを手で保持されています。その後、付属のフィルター付きバイアルを加熱ブロック上に配置し、熱蒸発化合物は、3分のために収集されます。システムの基本コンポーネントと同様にセットアップを図1に示されている。この最後の蒸気相抽出工程の後にまだ接続されているフィルタを使用してバイアルをラック上に配置し、クールダウンに許可されています。 フィルタは、再び室温に達したときは、インサートを装着した1.5 mlのGC -バイアルにジクロロメタンの150ミリリットルで溶出されています。バイアルに蓋をし、GC / MSによって分析されているフィルタから、残りの溶剤を吹き変える。 スプリット/化学イオン化モード（CI）で動作質量分析計とのインターフェーススプリットレスインジェクター（スプリットレスモード250℃、注入量1μ）の分析に使用する必要がある装備、ガスクロマトグラフ）。化合物は、40で開催されたHP - 1MS列（30M X 0.25ミリメートルX025μm）·キャリアとしてヘリウム注入後1分間、C、およびその後15でプログラムされた温度° C / minで250℃まで（10分間）、上で分離されていますガス（定流量0.7ml/min）。 MSベースの分析の両方の場合は、quadropole（例えば、アジレントHP5973）とイオントラップベース（例：バリアンサターン2200）質量分析計を使用することができます。 CIガスイソブタン（ガスのタンクに来る）やメタノール（液体タンクからの蒸気が使用されている）のどちらかを使用することができますよう、しかし、それぞれのケースでイオン化反応のフラグメントは、選択されたイオン数（SIC）プログラムの前にチェックしてください作成されます。我々は、CIの試薬 としてバリアンGC 3900/Saturn MS 2200のシステムおよびメタノールについては、次のプログラムに使用されている：5.00 - 11.30minイオン（M +1）+ 153〜158（サリチル酸メチル153、メチル2 H 5 -サリチル酸）; 11.30 - 13.30minイオン（M +1）+ 207〜228（ジャスモン酸メチル207と225、メチルジヒドロジャス209および227）、13.30 - 16.30minイオン（M +1）+ 237〜300（メチルアブシジン酸261、メチル2 H 6 -アブシジン酸267（アブシジン酸は、主に[MH 2 O +1] + イオンを生成する）。すべての化合物は、本物の市販の標準との比較によって識別されるべきである。JA、SA、およびABAの定量はピーク面積を相関させることによって行われます。それぞれの内部標準のピーク面積（抽出されたイオン）と（イオンを抽出）し、また使用される植物材料の生体重に基づいている。
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ここで紹介する方法は、化合物のメチル化、サイズおよび化合物の化学的性質が抽出されることを防ぐしないことを提供し、気化をシグナリング植物の広い配列のために確実に動作することが実証されています。また、それは、本明細書に記載されているメチル化法は、誘導体化の唯一の方法ではありません。 Silyllationとアセチル化は、別の方式とプロトコルであり、簡単にオンラインで見つけることができます。
質量分析計は、プロセスからあまりにも多くの不要なイオンを排除するために、実行中に記録されている限定すべき質量範囲を監視する単一イオンに対応していない場合。例えば、ジャスモン酸（JA）とその内部標準ジヒドロジャスモン酸（dhJA）は、2つのメジャー（M +1）+ イオン、JAのための207と225、およびメタノールと化学イオン化時のdhJAのための209及び227を生成する。これら2つの主要な（M +1）+ の質量（JA用207、225、dhJAのための209および227は）ので、同じ豊富rationfor JAとdhJAを持っていない、彼らは両方の抽出および定量化のために使用する必要があります。したがって、207から228までの質量範囲を記録し、特定のイオンが、後で抽出する必要がある。
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