Channelrhodopsin2 опосредованная стимуляция синаптические потенциалы в Drosophila Нервно-мышечная переходов

Часть 1: уход животных и генетического кресты

1. Поддерживать UAS-ChR2 и OK371-GAL4 летать линий в отдельных флаконах, содержащих стандартные носители летать ^8.
2. Сбор дев OK371-GAL4 летать линий и самцов UAS-ChR2 линий.
3. Положите обе мужчин и женщин в флакон, содержащий стандартные носители летать смешать с 1 мМ полностью транс-сетчатки (ATR). ATR пища должна быть сделана первая плавка на регулярных средах летать в микроволновой печи в течение ~ 1 минуты. Как только растаял, дайте ему остыть в течение приблизительно 30 секунд до одной минуты, а затем добавить 100 мкл 100 мМ АТР в 100% этанола на каждые 10 мл летать СМИ. Место флаконах по льду, затем хранить в темном месте при температуре 4 ° C.
4. Давайте мухи спариваются и откладывают яйца в темном месте на 22-25 ° C.
5. Подождите 3-4 дня до третьего возраста личинки видны, в тот момент, распоряжаться взрослых мух.

Часть 2: Буровая установка

1. Приложите любые 10x рассекает часть рамки глаза (в нашем случае, от Carl Zeiss, Inc, www.zeiss.com, Торнвуд, Нью-Йорк), на синий светодиодный источник света с радиатором (Thor лаборатории, www.thorlabs.com, Ньютон, штат Нью-Джерси ). Присоединить к магнитным основанием с должности и зажимом. Крышка радиатора с заземлены щит для уменьшения электрических шумов, генерируемых источником света.
2. Место магнитной базе с источником света в эфире таблице электрофизиологии буровой установки.
3. Подключение источника света к цепи управления и подключения цепи управления для внешнего источника напряжения (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Колорадо-Спрингс, CO).
4. Дайте 1-5 V импульсы на цепи управления, чтобы активировать синий свет.
5. Отрегулируйте магнитным основанием и источником света, пока синий луч света направлен на площадь будет занимать личиночной рассечение.

Часть 3: Dissection

1. Место шесть 0,1 мм насекомых булавки в пол sylgard подкладке блюдо.
2. Удалить ^3-го возраста личинки от пищи и место средств массовой информации в любой пластиковой Петри-блюдо.
3. Промыть личинки физиологическим раствором для удаления остатков пищи.
4. Место личинок в рассекает блюдо рядом вытащил булавки и добавить солевой до ½ уровне.
5. Восток личинки, так что вы можете увидеть две серебристые трубки (трахеи) вдоль спинной поверхности животного.
6. Вставьте большой контактный прямо в хвост между трахеи трубки. Держите личинки вниз и место второй большой палец в его голове, будучи уверенным, чтобы растянуть тело из продольно.
7. Сделайте небольшой надрез около хвоста, и продолжать его длине тела. Убедитесь, что кончики ножницами подняты так, чтобы не случайно сократить вентральной нервах и / или мышцах стенки тела.
8. Место четыре контакта на четырех углах животного теперь открыт животик. Установите их в рассекает блюдо так, чтобы филе животного. Pin подготовки из учили.
9. Использование щипцы и ножницы, удалить внутренности животного, трахеи и жира тела.
10. Промыть приготовительный с физиологическим раствором.
11. Найдите лобных долей (как показано на рис) и брюшного ганглия преп.
12. Использование микро-ножницы, аккуратно разрезать брюшную ганглия позади лобных долей.

Часть 4: запись в мышцах и синий световой стимуляции

1. Вытяните 10-20 μω электрода с помощью электронной съемник электрода (Саттер Instruments).
2. Заполните вытащил электрод с 3 М KCl.
3. Место заполнены электрод в держатель электрода и наконечника маневра электрод с микроманипулятора ближайшее личиночные приготовительные под микроскопом на вскрытии электрофизиологии буровой установки.
4. Определить мышц 6 (M6) в любом сегменте стенки тела (рис.).
5. Осторожно вставьте электрод в M6 и наблюдать за быстрым гиперполяризации. Мышцы отдыхают потенциалов мембраны должна быть от -30 мВ до -70 мВ.
6. Отрегулируйте синий свет так, что расчлененный приготовительные находится в центре светового луча.
7. Дайте 20-100 мс импульсов напряжения цепи управления. Поэтапно увеличения напряжения, подаваемого на цепи управления. Следите за возбуждающим потенциалом перехода в мышечную клетку (рис. 1В).

Представитель Результаты:

Рисунок 1А показывает схема установки записи и филе подготовки. На рисунке 1б показаны типичные EJP вызванных короткими импульсами света. EJP амплитуды показали суммируются амплитуды от двух моторных нейронов известны как иннервируют M6. Нижняя интенсивности света активируется только один блок двигателя (данные не приведены).

Рисунок 1:) Общая схема внутриклеточных установки записи и с синим светодиодом. Мозг (Br) удаляется для подавления ритмической активности в брюшной ганглий (VG). ChR2 выражается в моторных нейронов использованием GAL4-UAS системы. Б) внутриклеточные записи с M6 мышцы. 40 мс синие световые импульсы (при 127 мВт / мм ²⁾ надежно вызывают большой синаптических потенциалов (звездочки) в М6.

Критические шаги включают в себя как начальное вскрытие и внесение мышечные клетки. Если нервы вырезать или мышца повреждена во время начальной вскрытия трудно продолжать остальной эксперимента. Во время вскрытия, нужно быть очень осторожным, чтобы угол рассекает ножницы вверх как можно больше во время спинного разреза. Во второй важный шаг, вводя мышечных клеток, нужно следить за гиперполяризации прошлого ~ 30 мВ. Значения выше -30 мВ показывают, что электрод или не должным образом в мышечных клетках или в нездоровых клеток.