Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

Parte 1: la cura degli animali e croci genetica

1. Mantenere UAS-ChR2 e OK371-GAL4 linee di volare in bottiglie separate contenenti supporti standard ⁸ volare.
2. Raccogliere vergini di OK371-GAL4 linee volo ed i maschi di UAS-ChR2 linee.
3. Mettere maschi e femmine in una fiala contenente dei media volare miscela standard con 1 mM tutto-trans retinico (ATR). ATR cibo dovrebbe essere presa da primo media volare fusione regolare in un forno a microonde per circa 1 minuto. Una volta sciolto, lasciare raffreddare per circa 30 secondi a un minuto e poi aggiungere 100 ml di 100 mM ATR in 100 ETOH% per ogni 10 ml di media volare. Fiale luogo il ghiaccio, quindi memorizzare in una zona al buio a 4 ° C.
4. Lascia compagno di mosche e depongono le uova in una zona al buio a 22-25 ° C.
5. Attendere 3-4 giorni fino al 3 larve instar sono visibili, a quel punto, disporre di mosche adulte.

Parte 2: configurazione Rig

1. Allegare eventuali 10x dissezione oculare portata (nel nostro caso, da Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), al blu sorgente luminosa a LED con dissipatore di calore (laboratori di Thor, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Fissare a base magnetica con post e morsetto. Coprire dissipatore con uno schermo a massa per ridurre il rumore elettrico generato dalla sorgente luminosa.
2. Luogo base magnetica con sorgente di luce sul tavolo aria di elettrofisiologia rig.
3. Collegare la fonte di luce per il controllo del circuito e collegare al circuito di controllo di tensione esterna (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
4. Dare impulsi di 1-5 V per circuito di controllo per attivare la luce blu.
5. Regola base magnetica e la fonte di luce fino a fascio di luce blu è focalizzata sulla zona da occupata da dissezione larvale.

Parte 3: Dissection

1. Luogo sei pin 0,1 millimetri di insetti sul pavimento di una sylgard alberato piatto.
2. Rimuovere un 3 ^° larve instar dai media cibo e il luogo in qualsiasi plastica Petri-piatto.
3. Sciacquare larve con soluzione salina per rimuovere gli alimenti.
4. Larve posto nella dissezione piatto vicino al pin tirato e aggiungere saline al livello ½.
5. Orientare le larve in modo che potete vedere due tubi argentati (trachea) che corre lungo la superficie dorsale dell'animale.
6. Inserire un perno di grandi dimensioni direttamente in coda tra i tubi tracheali. Tenere le larve verso il basso e inserire un secondo perno di grandi dimensioni in testa, avendo cura di allungare il corpo in senso longitudinale.
7. Fai una piccola incisione vicino alla coda, e continuate in su la lunghezza del corpo. Assicurarsi che le punte delle forbici sono allevati in modo da non tagliare accidentalmente nervi ventrale e / o dei muscoli della parete del corpo.
8. Posto quattro perni sui quattro angoli del tronco dell'animale ormai aperto. Metterli nel piatto dissezione in modo da raccordare l'animale. Preparazione pin out insegnato.
9. Con pinze e forbici, togliere viscere dell'animale, trachea e corpi grassi.
10. Sciacquare la preparazione con soluzione salina.
11. Individuare i lobi frontali (come si vede in Fig. A) e ganglio ventrale della preparazione.
12. Utilizzando micro-forbici, tagliare con attenzione attraverso il ganglio ventrale appena dietro i lobi frontali.

Parte 4: la registrazione e la stimolazione muscolare azzurro

1. Tirare un 10-20 elettrodo μω utilizzando un elettrodo estrattore elettronico (Sutter Instruments).
2. Riempire l'elettrodo tirato con 3 M KCl.
3. Luogo pieno di elettrodi nel porta elettrodo e elettrodo punta manovra con un micromanipolatore vicino preparazione larvale sotto microscopio da dissezione elettrofisiologia su rig.
4. Identificare muscolare 6 (M6) in ogni segmento di parete del corpo (Fig. A).
5. Inserire con cautela elettrodo nella M6 e guardare per iperpolarizzazione rapida. Potenziali di membrana muscolare a riposo dovrebbe essere ovunque da -30 mV a -70 mV.
6. Regolare la luce blu in modo che la preparazione è centrata sezionato in fascio di luce.
7. Dare impulsi di tensione 20-100 ms per il controllo del circuito. Aumentare in misura apprezzabile tensione fornita al circuito di controllo. Guarda per i potenziali di giunzione eccitatori nella cellula muscolare (Figura 1B).

Rappresentante dei risultati:

La figura 1A mostra uno schema del sistema di registrazione e la preparazione in filetti. Figura 1B mostra EJP tipici evocato da brevi impulsi di luce. Ampiezza EJP mostrata è riassunta ampiezza da due neuroni motori conosciuta da entrambe le innervare M6. Intensità di luce inferiore solo attivato una unità di motore (dati non riportati).

Figura 1: A) Schema generale di un impianto di registrazione intracellulare e con LED blu. Cervello (Br) viene rimosso per inibire l'attività ritmica nel ganglio ventrale (VG). ChR2 è espresso in neuroni motori utilizzando il GAL4-UAS sistema. B) la registrazione intracellulare da un muscolo M6. 40 ms impulsi di luce blu (a 127 μW / mm ²⁾ affidabile evocano grandi potenzialità sinaptiche (asterischi) in M6.

Passaggi critici coinvolgono sia la dissezione iniziale e l'ingresso delle cellule muscolari. Se i nervi vengono tagliati o muscolo viene danneggiato durante la dissezione iniziale è difficile continuare il resto della sperimentazione. Durante la dissezione, bisogna stare molto attenti a sezionare le forbici angolo verso l'alto il più possibile durante l'incisione dorsale. Durante il secondo passo fondamentale, entrando in una cellula muscolare, si deve guardare per un passato iperpolarizzazione ~ 30 mV. I valori superiori a -30 mV indicano che l'elettrodo sia o non correttamente all'interno di una cellula muscolare o in una cella malsana.