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 JoVE Biology

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

1, 2

1Department of Biology, Johannes Gutenberg-University Mainz, Germany, 2Proteomics division, AlPlanta, Neustadt an der Weinstrasse, Germany

Article
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    Summary

    Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid mit Standard-Reagenzien einzuführen.

    Date Published: 5/11/2009, Issue 27; doi: 10.3791/1135

    Cite this Article

    Laible, M., Boonrod, K. Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids. J. Vis. Exp. (27), e1135, doi:10.3791/1135 (2009).

    Abstract

    Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Mit dieser Methode wird die geklonte Zielgen kann durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid verändert werden. Es funktioniert einfach durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die das gewünschte Mutation in die neu synthetisierte Plasmid integriert. In diesem Video-Tutorial zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid einzuführen. Das Protokoll arbeitet mit Standard-Reagenzien und ist unabhängig von kommerziellen Kits, die oft sehr teuer. Anwendung dieses Protokolls können die Gesamtkosten einer Reaktion auf ein Achtel von dem, was es kostet mit einigen der kommerziellen Kits reduzieren. In diesem Video, das wir auch auf kritischen Schritte Kommentar während des Prozesses und geben detaillierte Anweisungen, wie die mutagene Primer-Design.

    Protocol

    Das Prinzip der Methode:

    Die Mutagenese des gesamten Plasmide erklärt in diesem Video ist eine Mutagenese-Methode, die Sie zu einem geklonten Zielgen durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid ändern können. Es funktioniert durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die die gewünschten Mutation in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid, werden in die neu synthetisierte Plasmid integriert. Nach dem Entfernen des ursprünglichen Plasmid aus der Reaktion des mutierten Plasmid wird in E. verwandelt coli. Die folgenden Schritte sind für Screening-Zwecke nur, weil die Mutation Effizienz dieser Methode ist nicht 100%. Die ganze Prozedur dauert drei Tage, aber der größte Teil innerhalb eines Tages durchgeführt werden.

    1,0 Tag eins:

    1,1 Thermocycling Reaktion:

    Original-Plasmid: Diese Mutagenese-Protokoll funktioniert am besten mit Plasmiden bis zu 10kb. Größere Plasmide sind ein bisschen schwierig, mit dieser Methode mutieren und etwas Geduld und Anpassung der Thermocycling Bedingungen und / oder der zuständigen Zellen. Außerdem das Plasmid, das Sie mit muss von einem Damm + Bakterienstamm isoliert werden. Für die Thermocycling Reaktion, die Sie benötigen 10 bis 60 ngs des Plasmids Sie mutieren.

    Grundierungen: Bevor Sie einrichten können Ihre Thermocycling Reaktion müssen Sie Ihre Primer zur Hand haben. Sie benötigen etwa 150 ng eines jeden mutagene Primer. Es ist ok, wenn man 1,5 ul einer 1:10 verdünnten 100 pM Bilanz zu ziehen. Es gibt ein paar einfache Richtlinien, die Sie bei der Gestaltung Ihrer mutagene Primer muss:

    • Die Primer sollten komplementär zueinander
    • Die Primer sollten zwischen 25 und 45 Nukleotide lang sein
    • Die Mutationen in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid muss in beide Primer enthalten sein
    • Das Missverhältnis sollte in der Grundierung zentriert und flankiert von mindestens 8 Nukleotiden auf jeder Seite
    • Die Primer sollten eine GC-Gehalt von mindestens 40%
    • Die Primer sollten 5 prime und 3 prime mit einem oder mehreren Gs oder Cs Ende
    • Die Primer müssen nicht phosphoryliert werden, noch müssen sie FPLC oder PAGE gereinigt, lediglich entsalzt sie sein sollten.
    • Für die Berechnung der Tm Sie brauchen keine Formel, sondern Tm auf den Versand-Zertifikat sollte höher sein als 60 ° C.
    • Für Screening-Zwecke ist es praktisch, einfügen oder löschen Restriktionsstelle mit Ihrem Mutation. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gibt es viele Möglichkeiten, um eine Restriktionsschnittstelle mit Ihrem gewünschten Mutation einfügen. Die Website des New England Biolabs bietet ein Werkzeug, um eine solche geeignete Restriktionsschnittstelle zu finden. Geben Sie einfach Ihre Primer-Sequenz kodierend für die Aminosäuresequenz Sie es wünschen, mit der Mehrdeutigkeit Code für DNA. Das Enzym-Finder-Tool wird Ihnen sagen, welche Restriktionsstellen parallel zu Ihrem gewünschten Mutation eingeführt werden. Wenn Sie nicht finden können, eine mögliche oder praktische Restriktionsstelle durch diese Weise können Sie neue Restriktionsschnittstelle ohne Bezug auf den genetischen Code an der Stelle der Mutation einfügen. Danach können Sie mit diesem Plasmid als Template für eine Reihe von Mutationen in dem dieser Restriktionsstelle durch Einfügung des neuen mutagene Primer gelöscht werden. Dieser Ansatz kann sehr praktisch, wenn Sie planen, eine Reihe von Mutationen an der gleichen Stelle des Plasmids zu tun haben.

    DNA-Polymerase: Für dieses Verfahren benötigen Sie eine thermostabile DNA-Polymerase, die 3'-5 'Exonuklease-Aktivität aufweist und schafft stumpfen Enden. Wir verwenden immer rekombinante Pfu-Polymerase von Fermentas. Wenn Sie Probleme mit der Verstärkung Schritte haben Sie vielleicht versuchen, eine höhere Qualität Polymerase, aber für die meisten Zwecke der Standard Pfu genug sein. Vervollständigen Sie die Reaktion mit dNTPs, Polymerase-Puffer und Wasser.

    1,2 Thermocycling Bedingungen

    Die Thermocycler sollte in folgender Weise eingestellt werden. Die erste und wiederkehrende Denaturierung Phase ist es, 30sec bei 95 ° C eingestellt

    Die Annealingtemperatur der Primer darf nicht mit komplizierten Formeln berechnet werden. Wir in der Regel legen Sie die Annealingtemperatur auf 55 ° C und die Glühzeit zu einer Minute. Für Primer 25 bis 30 Nukleotiden, die Sie verwenden werden meistens funktioniert dies für uns 95% der Zeit. Jedenfalls, wenn dies nicht funktionieren sollte, versuchen Sie einfach die Variation der Annealing-Temperatur zwischen 50 - und 60 ° C.

    Die Dehnung ist abhängig von der Polymerase die Sie benutzen. In dieser Demonstration verwenden wir die Pfu-Polymerase von Fermentas, die für eine Dehnung Temperatur von 72 ° C nennt Die Dehnung der Zeit variiert je nach Größe des Plasmids. Wir sind immer zu berechnen 1 min pro kb, und fügen Sie eine zusätzliche Minute an, dassZeit. Zum Beispiel für eine 9kb Plasmid wir wählen würden 10min als Dehnung der Zeit.

    18 Zyklen ausreichend sind, um zu schaffen genug mutierte Plasmid für die weitere Verwendung. Keeping die Anzahl der Zyklen gering ist, spart auch Zeit.

    Abbildung 1

    1,3 Gelcheck nach thermischer Reaktion

    Die erfolgreiche Amplifikation sollte mittels einer Elektrophorese überprüft werden. Direkt nach dem Radfahren beendet ist, laden 5 ul der Reaktion auf ein 1% TAE-Agarosegel. Wenn die Verstärkung erfolgreich war, sollten Sie eine deutliche Bande. Allerdings, wenn das neu synthetisierte DNA ist nicht deutlich sichtbar auf dem Gel, können Sie versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in den nächsten Schritt. Für uns hat nur selten gearbeitet, aber es lohnt sich zu versuchen. Das Beste, was zu tun ist, wenn die Reaktion nicht funktioniert ist die Glühtemperatur anzupassen.

    1,4 DpnI Verdauung:

    Vor Transformation der ursprünglichen Plasmid, das als Vorlage diente müssen aus der Reaktion auf starken Hintergrund zu verhindern entfernt werden. Dies wird durch Restriktionsverdau mit DpnI getan. Diese Restriktionsendonuklease schneidet nur methylierte Plasmid. Seine Anerkennung und Restriktionsstelle wird die Sequenz GATC, während A hat methyliert werden. Wenn Verdau mit DpnI nur das Original nicht mutierten Plasmid, das von einem Damm isoliert + Stamm geschnitten wird, ist das neu synthetisierte mutierte Plasmid, das nicht methylierte nicht durch DpnI betroffen. Einfach geben Sie 1-2 pl DpnI, um die Reaktion und inkubieren sie mindestens eine Stunde bei 37 °. Bei Verwendung des Schnell verdauen DpnI die Inkubationszeit kann bis etwa 15 Minuten verringert werden. Die Qualität Ihrer DpnI und die Inkubationszeit dieser Restriktionsverdau stark bestimmt, wie stark Ihr Hintergrund mit mutierten Plasmid wird.

    1,5 Transformation:

    Nach DpnI Verdauung des Plasmids ist bereit für die Umwandlung in die zuständige E. coli-Zellen. Fügen Sie einfach 5 pl vom DpnI Abbaureaktion in die kompetenten Zellen und die Transformation wie in Ihrem Labor empfohlen. In unserem Fall verwenden wir das Hitzeschock-Verfahren durch Inkubation der Bakterien-Plasmid-Mischung auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock es bei 42 ° C für 90 sek. Nach Zugabe von 200 ul SOC-Lösung werden die Bakterien inkubiert, kräftiges Schütteln bei 37 ° C für 1 h. Nach 1 Stunde werden die Bakterien auf die Auswahl-Agar ausplattiert.

    2,0 Tag zwei

    2.1 Abschirmung der Klone Teil 1: Auswahl der Klone

    Da die Mutation Effizienz ist nicht 100% Sie brauchen, um für Ihre Mutanten Bildschirm. Wir tun dies durch Restriktionsverdau, in denen wir prüfen für An-oder Abwesenheit der Restriktionsschnittstelle, die wir hinzugefügt oder gelöscht durch Primer-Integration. Zu diesem Zweck haben wir in der Regel abholen acht Kolonien und wachsen sie über Nacht für Plasmid-Präparation auf den nächsten Tag.

    3,0 Tag drei

    3,1 Screening der Klone Teil 2: Restriktionsverdau mit Markerenzym

    Am dritten Tag Sie eine Mini Prep und anschließende Restriktionsverdau mit Ihrem Markerenzym. Auf dem Gel können Sie dann sehen, welche Ihrer Klone tragen die gewünschte Mutation und welche nicht.

    Das Screening-Verfahren mit Restriktionsverdau funktioniert sehr gut. Dennoch sollten Sie Ihre erfolgreiche Mutation durch Sequenzierung bestätigt.

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    Discussion

    Seite Mutagenese ist eine Mutagenese-Verfahren, das eine schnelle Möglichkeit, ein Gen von einem Plasmid durchgeführt mutieren zur Verfügung stellt. Die gesamte Reaktion kann in nur einem Tag durchgeführt werden. Mit dieser Methode wird es brauchen nur ein Paar kostenlose Primer, die die gewünschten Mutationen und das Korrekturlesen Polymerase wie Pfu-Polymerase. Die neu synthetisierte Plasmid kann von den Eltern Plasmid durch Verdauen der Reaktion mit dem Restriktionsenzym DpnI getrennt werden. Dieses Enzym verdaut nur die methylierte DNA. Deshalb nur die neu synthetisierte Plasmid transformiert werden kann. In diesem Tutorial haben wir gezeigt, Durchführung einer Mutagenese mit einem hausgemachten Mutagenese-Kit. Der Vorteil dieses Kits ist die Kostenersparnis, während die Wirksamkeit bleibt. Die kritischen Punkte dieser Methode sind die Primer-Design und der Glühtemperatur. Bei den neu synthetisierten DNA kann nicht visualisiert werden nach der Elektrophorese, die kann das Scheitern der Methode zeigen, kann man versuchen, Niederschlag der ganzen Reaktion und verwenden es für die Transformation in Bakterien. Doch der beste Weg, um dieses Problem zu lösen versucht, die Annealingtemperatur zu optimieren oder erhöhen Sie die Länge der konstanten Region in den Primern. Ferner kann mit einem hochwertigen Polymerase oder Restriktionsenzym verbessern auch die Empfindlichkeit der Reaktion. Die kompetenten Zellen sind auch ein wichtiger Faktor, der Erfolg der Methode Effekte. Deshalb Mitte (107 KBE / ug DNA) oder stark (109 KBE / ug DNA) kompetente Zellen sind zu bevorzugen.

    Obwohl in diesem Tutorial werden wir nicht zeigen, das Löschen oder Einfügen, indem Sie die hausgemachten Kit, waren wir erfolgreich, diese in unserem Labor zu tun. Wir konnten erfolgreich ersetzen, einfügen oder löschen Sie mindestens 3 Basen zur gleichen Zeit.

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    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Pfu polymerase (recombinant or native) Fermentas EP0571 or EP0501
    dNTP mix 10 mM Fermentas R0191
    DpnI or DpnI Fast digest Fermentas ER1701
    primers Invitrogen desalted

    References

    1. Papworth, C, Bauer, JC, Braman, J, Wright, DA QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies 1996, 9:3-4

    Comments

    33 Comments

    I know your publication is not about a kit, but I was wondering if you can help me. Using a kit, I get through the amplification step with a product, but the transformation is unsuccessful. The control plasmid I use in every transformation (has not undergone amplification) gives positive results. I tried lengthening the extension time, yet still, no colonies. Do you have any idea what could be wrong? I've heard about duplication of primers during amplification. Do you think this could be the problem? Unfortunately, I don't have a restriction site where I need the mutation. Thank you for any help!
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 23, 2009, 2:11 PM

    Another reason why the transformation is not working, could be the size of your plasmid. With large plasmids we also have problems in transformation. Try using very high competent cells or even electroporation. Hope I could help you.
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 31, 2009, 8:04 AM

    Hi Leah, which kit are you using? DŒs it use the same principle as we use? There are other kits on the market where you have to perform ligation prior to transformation (Phusion kit from neb). You may also check if it actually is the right plasmid you are amplifiying by performing restriction digestion with it after amplification and comapre it to your input plasmid. Otherwise you could use your input plasmid as control plasmid in transformation to check if it gives colonies. To help you more, I need more information about the kit your using and any points were you vary from the original protocol.
    Best wishes
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 24, 2009, 4:56 PM

    Mark, I was using a Stratagene Kit. I used my input plasmid as the transformation control, and that dŒs give colonies. I gave up on the kit and tried your method. I get a few colonies, but now am not sure if the plasmid was mutated properly. It's a long and complicated discussion! I would type it if you have time to read it! :)
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 6, 2009, 11:59 AM

    Hello,
    I was wondering if you need to do ligation with this protocol.
    Also, if the primers are complementary, is there much likelihood of producing primer dimers, and how can we overcome that?

    Thanks for you help
    Reply

    Posted by: Jyoti D.March 16, 2010, 12:01 AM

    Hi,
    ligation is not needed in this protocol. Normally no problems are observed with primer dimers if you stick to the protocol (ca ²5-45 bp primers with at least 8 perfectly matching bases on either side of the mismatched region). If you have problems, you can try to make the primers shorter. By the way, purification of primers (HPLC or PAGE) will also enhance the efficiency and accuracy of the reaction.

    Have fun
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 16, 2010, 5:53 PM

    i ordered the finnzyme,s (phusion) kit for site directed mutagenesis. and in that kit the primer designing was different. i have primers which are designed back to back and they are 5' phosphorylated(for lagation purpose). kindly guide me if i can use these primers with this protocol. coz unfortunately i didn get that kit. i have to complete this part of my work in a week. i m relly worried.
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 2, 2010, 2:23 PM

    those primers are not overlapping and one of them have mutation (single). in taht kit they used hot start DNA polymerase. i have used the pfu polymerase. but got ambigous result. there were ² bands in pcr product. one of 3.5kb(size of vector(ptz) +my gene) and a 3 kb band. i wonder Y pcr produced ² bands :(
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 2, 2010, 2:31 PM

    Hi Aliya, I would assume that you can exchange the phusion polymerase for the standard pfu (and reverse)as they both have the same basic functions (generating blunt ends, no strand displacing activity, proofreading). Also the orientation and design of the primers can vary a lot between different mutagenesis protocols available, so there are definetely many ways to mutate a plasmid. In your case I would say it's ok to use pfu instead of phusion as long as you use the correct cycling conditions. If you get two bands, you could either play around with the cycling conditions and/or primer design or you could just simply extract the band of correct size and use it for the ligation. Hotstart polymerases have several advantages (mainly higher specificty) but they are not necessarily needed. If you still have problems, you may also order new primers and stick with the protocol above. Hope this will help you.
    Have fun
    Mark
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2010, 4:48 PM

    Hi Mark, i have recently ordered new primers (overlapping primers having mutation in middle of the sequence) but i i can,t add a restriction site in them coz mutation is in middle of my gene. and in ur protocol u didn mentioned about the size i mean the plasmid plus insert which u r using. my plasmid is of ².8 and my gene is about .5kb. would this procedure work for this size of DNA. and how the nick protroduced in the strands would be sealed in the end. and another question is in fermentas prescribed manual for pcr wd pfu polymerase it is mention that the extension time should be ²min/kb. which makes almost 1² min for my DNA. what should i do now.
    thanx for ur guidence
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 15, 2010, 1:55 AM

    can u tell me the mechanism of this method. how many copies of mutated plasmid will be produced by this method from pcr of single unmutated plasmid. i am a bit confused how the primers aneal and synthesis more copies from newly synthesized strands in next cycles of pcr.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 29, 2010, 12:35 PM

    Hi Shazar,
    the plasmid amplification works by a non PCR based thermocycling reaction (no exponential amplification but a linear one, similar to sanger sequencing just without disrupting nucleotides). The amount of mutated plasmid will be increased by the amount of input plasmid with every cycle, assuming the reaction is 100% efficient. So if you use 50ng of template, after the first cycle there should be 50ng of mutated plasmid, after the second cycle 100, after the third 150ng and so on. The amplification only takes place on the original plasmid and not on the newly synthesized (to my best knowledge). The newly synthesized plasmid strands then form plasmids with nicks in each strand which lie at the 5 prime end of each of the primers. If you transform this nicked plasmid into E. coli the nicks get repaired and result in a normal plasmid. I think in the video there's a scheme of the amplification process. If you cant acces the video you can view the article which the viedo is based on (in german). It contains the same scheme. www.laborjournal.de/rubric/tricks/tricks/trick1²6.lasso
    All the best
    Mark
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 29, 2010, 5:28 PM

    Hi,
    I have the problem of primer dimer with this protocol and i did not find any band after gel then i redesigned the primer which are partially overlaping and it works well in the first time and i got a good band
    but when i repeat it again it failed -----i used the same primers but changed only one amino acid in the same position
    i do not know what should I do ?
    any advise will be helpful to me
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 7, 2011, 10:43 PM

    Hello Friends..
    Well iam working on Site-directed mutagenesis of one gene coding for one enzyme,however i dont get desired mutant ,sequencing results in undesirable mutation beside desired mutation. I follow strategene quick change mutagenesis protocol. I use pET²8a vector.Could anyone please guide how to adress this issue..Thanks fr d help..
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 12, 2011, 5:14 AM

    Hi Shad,
    have you made sure that the undesired mutation was caused by the mutagenesis and was not present already before? If the undesired mutation appears in a region outside the one you are mutating, simple check some more colonies. As the mutagenesis is based on a linear amplificaation undesired mutations should not be propagated and therefore not present in most of the colonies. However if the mutation lies in the region of your primers, go and check their sequence once again (on the tube). During mutagenesis your primers are incorporated into the new plasmid, so if these are corrupted you will never get a good result. You could as well go for HPLC purified primers, which diminishes the risk of having a mixture of primers. Hope this helps you.
    Enjoy,
    Mark
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 12, 2011, 8:24 AM

    Thanks dear for your kind reply,
    i have ensured the mutations were not present prior amplification. Mutations were not in the primer as it is FPLC- HPLC purified. I get many deletion and insertion kind of muations. i even changed the Polymerase, from Pfu polymerse to Ex taq polymerase, still didnt work out.. Please help me out with a nice solution to this problem.. always thanks..
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 6, 2011, 10:20 PM

    I did this protocol for getting point mutants and i have been successful a couple of times. But recently i am noticing the sequence has multiple copies of mutated oligos. The primer sequence is concatenated and repeated several times in the mutated plasmid. The primers i used had a tm of 65 C and are ²8 bp long. What could be the problem ?
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 7, 2011, 10:18 AM

    Hi Sankar, I have not yet encountered the problem you describe. However I could imagine it is caused by pairing of the primers at their ends. You could check if the sequences could allow such a pairing and the maybe add some more bases to dimish dimerisation. You could also try raising the annealing temperature. Keep me posted. Mark
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 7, 2011, 11:55 AM

    Hi Sankar, I have not yet encountered the problem you describe. However I could imagine it is caused by pairing of the primers at their ends. You could check if the sequences could allow such a pairing and the maybe add some more bases to dimish dimerisation. You could also try raising the annealing temperature. Keep me posted. Mark
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 7, 2011, 11:55 AM

    Hey mutagenesis fans, if you have problems mutating large plasmids you can give this modified protocol a try. In a nutshell, the protocol works for well for large plasmids, makes use of KOD polymerase and only 6 amplification cycles are needed: http://www.zju.edu.cn/jzus/openiptxt.php?doi=10.1631/jzus.B1100180 (download quite slow but eventually works). Good luck and happy pipetting
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 2, 2011, 2:17 PM

    I have amplified ss DNA library of 60 mer size by assymetric PCR method using gradient primer(F.Primer 100uM R.prmer-10uM). i could able to amplify ss DNA libray ,however fail to isolate amplified DNA band from the Gel slab by Crush & Soak protocol.
    Thanks.

    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 16, 2012, 9:44 PM

    Hi all,
    I could't figure out how to us NEB tool to design primer bearing a new restriction site, which can be used for clones screening. could anyone share any tips on how to conveniently do so?
    Many thanks!
    Reply

    Posted by: Oleksiy K.March 20, 2013, 1:38 AM

    Dear Oleksiy K.

    My name is Ana Egana and I am the Technical Support Manager at New England Biolabs. I would like to invite you to contact us directly at info@neb.com with your questions. We will be happy to review the tool with you and provide you guidelines on how to use it for your intended purpose. We look forward to hearing from you.

    Sincerely,

    Ana
    Reply

    Posted by: Ana E.March 26, 2013, 10:10 AM

    Your Figure 1 seems to be broken.
    Reply

    Posted by: August P.March 21, 2014, 12:11 AM

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