Mutagenesi sito fatto in casa Regia di Plasmidi Whole

Principio del Metodo:

Il sito mutagenesi di plasmidi tutto spiegato in questo video è un metodo di mutagenesi che consente di modificare un gene bersaglio clonato attraverso la sostituzione, cancellazione o l'inserimento di alcune basi direttamente in un plasmide. Funziona, amplificando il plasmide intero, in modo non basati sulla PCR reazione termici. Durante la reazione di primer mutagenico, portando la mutazione desiderata in forma di mismatch al plasmide originale, sono integrati nel plasmide di nuova sintesi. Dopo la rimozione del plasmide originale dalla reazione del plasmide mutato si trasforma in E. coli. seguenti passaggi sono solo a scopo di screening, perché l'efficienza mutazione di questo metodo non è al 100%. L'intera procedura dura tre giorni, ma la parte principale può essere fatto in un giorno.

1,0 ° giorno:

1,1 reazione termici:

Plasmidi originale: Questo sito mutagenesi protocollo funziona meglio con i plasmidi fino a 10kb. Grandi plasmidi sono un po 'difficile da mutare con questo metodo e può prendere po' di pazienza e la regolazione delle condizioni termici e / o cellule competenti. Inoltre il plasmide che si lavora con deve essere isolato da una diga + ceppo di batteri. Per la reazione termici è necessario 10-60 NGS del plasmide si vuole mutare.

Primer: Prima di poter impostare la vostra reazione termici devi avere la tua primer a portata di mano. Avete bisogno di circa 150 ng di ogni fondo mutageno. E 'ok se si prende 1,5 ml di una soluzione 1:10 diluito al 100 pM magazzino. Ci sono alcune semplici linee guida è necessario considerare quando si progetta il vostro primer mutagenico:

• I primer devono essere complementari l'uno all'altro
• Il primer deve essere compreso tra 25 e 45 nucleotidi di lunghezza
• Le mutazioni nella forma dei disallineamenti al plasmide originale deve essere contenuta in entrambi i primers
• La non corrispondenza dovrebbe essere al centro del fondo e fiancheggiata da almeno 8 nucleotidi su ogni lato
• I primer dovrebbe avere un GC-Content di almeno il 40%
• I primer dovrebbe finire 5 Prime e 3 primi con uno o più G o Cs
• Il primer non devono essere fosforilata, né devono essere FPLC o PAGINA purificata, semplicemente dissalati dovrebbero essere.
• Per il calcolo della Tm non hai bisogno di alcuna formula ma Tm sul certificato di spedizione deve essere superiore a 60 ° C.
• Ai fini dello screening è pratico di inserire o eliminare un sito di restrizione con il tuo mutazione. A causa della degenerazione del codice genetico ci sono molte possibilità di inserire un sito di restrizione con la tua mutazione desiderata. Il sito web del New England Biolabs fornisce uno strumento per trovare un simile sito appropriato restrizione. Basta inserire la sequenza di innesco che codifica per la sequenza di aminoacidi che desideri, utilizzando il codice ambiguità del DNA. L'enzima strumento di ricerca vi dirà quali siti di restrizione può essere introdotto parallelamente al mutazione desiderata. Se non riesci a trovare alcun sito di restrizione possibile o pratico in questo modo, è possibile inserire un qualsiasi nuovo sito senza restrizioni riguardanti il ​​codice genetico nel sito di mutazione. Successivamente è possibile utilizzare questo plasmide come modello per una serie di mutazioni in cui questo sito di restrizione sarà cancellato dal inserimento del nuovo primer mutagenico. Questo approccio può essere molto conveniente se hai intenzione di fare una serie di mutazioni nello stesso sito del plasmide.

DNA polimerasi: Per questo metodo hai bisogno di una DNA polimerasi termostabile che presenta 3'-5 'attività esonucleasi e crea le estremità smussata. Usiamo sempre ricombinante Pfu-Polymerase da Fermentas. Se hai problemi con la procedura di amplificazione è possibile provare una polimerasi di qualità superiore, ma per la maggior parte degli scopi del Pfu standard sarà sufficiente. Completa la reazione con tampone polimerasi dNTPs, e l'acqua.

1.2 Condizioni termici

Il termociclatore dovrebbe essere istituito nel seguente modo. La fase iniziale di denaturazione e ricorrenti è impostato per 30 sec a 95 ° C.

La temperatura di annealing del primer non deve essere calcolato con formule complicate. Di solito impostare la temperatura di annealing a 55 ° C e il tempo di ricottura a un minuto. Per primer da 25 a 30 nucleotidi, che si prevede di utilizzare per lo più, questo funziona per noi il 95% del tempo. Comunque se questo non dovrebbe funzionare, basta provare variando la temperatura di ricottura tra i 50 - e 60 ° C.

La temperatura di estensione dipende dalla polimerasi in uso. In questa dimostrazione si usa il Pfu-Polymerase da Fermentas, che prevede un allungamento temperatura di 72 ° C. Il tempo allungamento varia a seconda delle dimensioni del plasmide. Abbiamo sempre calcolare 1 minuto per ogni kb, e aggiungere un minuto supplementare a quelladel tempo. Ad esempio, per un plasmide 9kb che sceglieremmo 10 minuti il ​​tempo di allungamento.

18 cicli sono sufficienti a creare abbastanza mutato plasmide per l'ulteriore utilizzo. Mantenere il numero di cicli a bassa, anche il tempo.

1,3 Gelcheck dopo la reazione termici

L'amplificazione di successo dovrebbe essere controllato eseguendo una elettroforesi. Subito dopo il ciclismo è finito, carico 5 l di reazione su un 1% gel di agarosio al TAE. Se l'amplificazione è stata eseguita correttamente, si dovrebbe vedere un gruppo distinto. Tuttavia, se il DNA di nuova sintesi non è chiaramente visibile sul gel, si può tentare di accelerare la reazione di tutto e usarlo per la trasformazione nella fase successiva. Per noi questo ha funzionato raramente, ma vale la pena di fare un tentativo. La cosa migliore da fare se la reazione non funziona è quello di regolare la temperatura di ricottura.

1,4 DpnI digestione:

Prima della trasformazione il plasmide originale che servì come modello deve essere rimosso dalla reazione per evitare forte background. Questo viene fatto con la digestione di restrizione DpnI. Questa endonucleasi di restrizione taglia solo metilati plasmide. Il suo riconoscimento e sito di restrizione è la sequenza GATC, mentre A deve essere denaturato. Durante la digestione con DpnI solo il plasmide originale immutata, che è stato isolato da una diga + ceppo viene tagliato, il plasmide mutato di nuova sintesi che non è metilato non è influenzata dal DpnI. Basta aggiungere 1-2 ml di DpnI alla reazione e incubare che almeno un'ora a 37 °. Quando si utilizza il veloce digerire DpnI il tempo di incubazione può essere ridotto a circa 15 minuti. La qualità della vostra DpnI e il tempo di incubazione di questa influenza notevolmente la digestione restrizione quanto sia forte il vostro sfondo con plasmide immutata sarà.

1,5 Trasformazione:

Dopo la digestione DpnI il plasmide è pronto per la trasformazione in autorità competenti E. coli cellule. Basta aggiungere 5 microlitri dalla reazione digestione DpnI nelle cellule competenti ed eseguire la trasformazione come raccomandato nel vostro laboratorio. Nel nostro caso usiamo la procedura di shock termico incubando i batteri-plasmide miscela in ghiaccio per 30 minuti e poi lo shock termico a 42 ° C per 90 sec. Dopo aver aggiunto 200 ul SOC-soluzione, i batteri vengono incubati, agitando vigorosamente, a 37 ° C per 1 h. Dopo 1 ora i batteri sono placcati sulla scelta dei supporti di agar.

2,0 secondo giorno

2,1 screening di cloni parte 1: Scelta dei cloni

Poiché l'efficienza mutazione non è al 100% è necessario per il vostro schermo mutanti. Facciamo questo digestione di restrizione in cui verificare la presenza o l'assenza del sito di restrizione che abbiamo aggiunto o eliminato attraverso l'integrazione primer. A questo scopo siamo soliti prendere otto colonie e farle crescere per tutta la notte per la preparazione plasmide il giorno successivo.

3,0 Terzo giorno

3,1 screening di cloni parte 2: digestione con enzimi di restrizione marcatore

Il terzo giorno si esegue un Prep Mini e la digestione con la conseguente restrizione degli enzimi marker. Sul gel poi si può vedere che uno dei tuoi cloni portano la mutazione desiderata e non quelli.

Il metodo di screening con digestione restrizione funziona molto bene. Tuttavia, si dovrebbe confermare la mutazione di successo mediante sequenziamento.

Mutagenesi sito-è un metodo di mutagenesi, che fornisce un modo veloce per mutare un gene portato da un plasmide. La reazione tutto può essere fatto in un solo giorno. Con questo metodo, sarà necessario solo un paio di primer omaggio portando le mutazioni desiderato e una polimerasi correzione di bozze, come Pfu-polimerasi. Il plasmide di nuova sintesi può essere separato dal plasmide genitoriale digerire la reazione con il DpnI enzima di restrizione. Questo enzima digerisce solo il DNA metilato. Quindi solo il plasmide di nuova sintesi può essere trasformato. In questo tutorial abbiamo dimostrato eseguendo una mutagenesi sito-specifica, utilizzando un kit di mutagenesi fatti in casa. Il vantaggio di questo kit è il risparmio economico, mentre l'efficacia rimane. I punti critici di questo metodo sono la progettazione primer e la temperatura di ricottura. Nel caso in cui il DNA di nuova sintesi non possono essere visualizzati dopo elettroforesi, che possono indicare il fallimento del metodo, si può tentare di accelerare la reazione di tutto e usarlo per la trasformazione nei batteri. Tuttavia il modo migliore per risolvere questo problema è cercare di ottimizzare la temperatura di ricottura o aumentare la lunghezza della regione costante nel primer. Inoltre, usando una polimerasi di alta qualità o enzima di restrizione può anche migliorare la sensibilità della reazione. Le cellule competenti sono anche un fattore chiave che il successo riscosso gli effetti di questo metodo. Quindi le cellule mezzo (107 ufc DNA / mg) o molto (109 ufc DNA / mg) competente sono preferibili.

Anche se in questo tutorial non ha dimostrato la cancellazione o l'inserimento utilizzando il kit fatti in casa, siamo riusciti a fare questi nel nostro laboratorio. Siamo stati in grado di sostituire con successo, inserire o eliminare almeno 3 basi allo stesso tempo.