Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Princípio do método:

O site dirigido mutagênese de plasmídeos toda explicada neste vídeo é um método de mutagênese que permite que você alterar um gene alvo clonado pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ele funciona, amplificando o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original, estão integrados no plasmídeo recém-sintetizada. Após a remoção do plasmídeo original a partir da reação do plasmídeo mutante se transforma em E. coli. Os passos seguintes são para fins de triagem somente, porque a eficiência de mutação deste método não é 100%. O processo todo leva três dias, mas a parte principal pode ser feito dentro de um dia.

1,0 O primeiro dia:

1,1 termociclagem reação:

Original Plasmid: Este site dirigido mutagênese protocolo funciona melhor com plasmídeos de até 10kb. Plasmids maiores são um pouco difícil de sofrer mutações com este método e pode levar um pouco de paciência e ajuste das condições de termociclagem e / ou células competentes. Além disso, o plasmídeo que você trabalha com deve ser isolado de uma represa + cepa de bactérias. Para a reação termociclagem você vai precisar 10-60 ngs do plasmídeo você quer se transformar.

Primers: Antes de você pode configurar a sua reação termociclagem você tem que ter o seu primers na mão. Você precisa de cerca de 150 ng de cada cartilha mutagênico. É ok se você tirar 1,5 mL de uma ação diluída 1:10 pm 100. Existem algumas orientações simples que você deve considerar ao projetar seu primers mutagénicos:

• Os primers devem ser complementares um ao outro
• Os primers devem ter entre 25 e 45 nucleotídeos de comprimento
• As mutações na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original deve ser contido em ambos os primers
• As incompatibilidades devem ser centrados na cartilha e ladeado por pelo menos 8 nucleotídeos em cada lado
• Os primers devem ter um GC Conteúdo de pelo menos 40%
• Os primers deve terminar 5 principais e 3 privilegiada, com um ou mais Gs ou Cs
• Os primers não precisa ser fosforilada, nem têm de ser purificados FPLC ou PAGE, apenas devem ser dessalinizada.
• Para o cálculo da Tm você não precisa de nenhuma fórmula, mas Tm no certificado de transporte deve ser superior a 60 ° C.
• Para fins de triagem é prático para inserir ou excluir um sítio de restrição com o seu mutação. Por causa da degeneração do código genético há muitas possibilidades para inserir um sítio de restrição com a sua mutação desejada. O site do New England Biolabs fornece uma ferramenta para encontrar tal um sítio de restrição apropriada. Basta digitar a seqüência de cartilha de codificação para a seqüência de aminoácidos que você deseja, utilizando o código ambigüidade de DNA. A ferramenta de localização da enzima irá dizer-lhe que sítios de restrição pode ser introduzido em paralelo à sua mutação desejada. Se você não consegue encontrar nenhum sítio de restrição possível ou prático desta forma, você pode inserir qualquer sítio de restrição novo sem se preocupar o código genético no local da mutação. A partir daí você pode usar este plasmídeo como modelo para uma série de mutações em que este sítio de restrição será eliminado através da inserção do novo primers mutagênico. Esta abordagem pode ser muito conveniente se você estiver planejando fazer uma série de mutações no mesmo local do plasmídeo.

DNA polimerase: Para este método você precisa de uma termoestável DNA polimerase, que exibe 3'-5 'atividade de exonuclease e cria termina sem corte. Usamos sempre recombinante Pfu Polimerase a partir Fermentas. Se você tem problemas com as etapas de amplificação, você pode tentar uma polimerase de maior qualidade, mas para a maioria dos propósitos do Pfu padrão será suficiente. Completar a reação com dNTPs tampão da polimerase e água.

1.2 Condições de termociclagem

O termociclador deve ser criado da seguinte maneira. A fase de desnaturação inicial e recorrente é definida como 30 seg a 95 ° C.

A temperatura de anelamento dos primers não devem ser calculados com fórmulas complicadas. Costumamos definir a temperatura de anelamento a 55 ° C eo tempo de recozimento para um minuto. Para primers de 25 a 30 nucleotídeos que você estará usando em sua maioria, isso funciona para nós 95% do tempo. De qualquer forma se isso não deve funcionar, simplesmente tente variar a temperatura de tratamento térmico entre 50 - e 60 ° C.

A temperatura alongamento depende da polimerase que você usa. Nesta demonstração usamos o Pfu Polimerase a partir Fermentas, que apela a uma temperatura de alongamento de 72 ° C. O tempo de alongamento varia de acordo com o tamanho do plasmídeo. Nós sempre calcular 1 min por kb, e adicionar um minuto extra para quetempo. Por exemplo, para um plasmídeo 9kb nós escolheríamos 10min como tempo de alongamento.

18 ciclos são suficientes para criar o suficiente mutante plasmídeo para o uso posterior. Manter o número de ciclos de baixa, também poupa tempo.

1,3 Gelcheck após reação termociclagem

A amplificação bem-sucedido deve ser verificado através da realização de uma electroforese. Diretamente após o ciclo terminar, coloque 5 mL da reação em um gel de agarose 1% TAE. Se a amplificação foi bem-sucedido, você deve ver uma banda distinta. No entanto, se o DNA recém sintetizado não é claramente visível no gel, você pode tentar precipitar a reação de todo e usá-lo para a transformação na próxima etapa. Para nós, isso raramente funcionou, mas vale a pena dar uma tentativa. A melhor coisa a fazer se a reação não funciona é para ajustar a temperatura de recozimento.

1,4 digestão DpnI:

Antes da transformação do plasmídeo original, que serviu como um modelo deve ser removido da reação para impedir de fundo forte. Isto é feito por digestão com restrição DpnI. Este endonuclease de restrição corta somente metilado plasmídeo. Seu reconhecimento e sítio de restrição é o GATC seqüência ao passo que A tem de ser metilado. Quando digerir com DpnI apenas o plasmídeo originais não mutada que foi isolado de uma represa + tensão é cortada, o plasmídeo recém-sintetizado mutante que não é metilado não é afetado por DpnI. Basta adicionar 1-2 mL de DpnI à reação e incubar pelo menos uma hora a 37 °. Ao usar o Fast digerir DpnI o tempo de incubação pode ser reduzida para cerca de 15 minutos. A qualidade de sua DpnI eo tempo de incubação desta digestão restrição muito forte determina como o seu fundo com plasmídeo não mutada será.

1,5 Transformação:

Após a digestão do plasmídeo DpnI está pronto para transformação em E. competente células coli. Basta adicionar 5 mL da reação de digestão DpnI nas células competentes e realizar a transformação, como recomendado no seu laboratório. No nosso caso, usamos o procedimento de choque térmico, incubando a mistura de bactérias plasmídeo em gelo por 30 min e depois de choque térmico é a 42 ° C por 90 seg. Após a adição de 200 mL SOC-solução, as bactérias são incubadas, vigorosa agitação, a 37 ° C por 1 h. Após uma hora as bactérias são semeadas em agar a seleção da mídia.

2,0 segundo dia

2,1 Triagem de clones parte 1: Seleção de clones

Porque a eficiência de mutação não é 100% você precisa de tela para o seu mutantes. Fazemos isso por digestão de restrição em que nós verificamos a presença ou ausência do sítio de restrição que nós adicionados ou excluídos por meio da integração primer. Para isso, geralmente pegar oito colônias e cultivá-las durante a noite para a preparação de plasmídeo, no dia seguinte.

3,0 Dia três

3,1 Triagem de clones parte 2: Restrição de digestão com a enzima marcador

No terceiro dia você executar um Mini Prep e digestão subsequente restrição da enzima com seu marcador. No gel, em seguida, você pode ver que um de seus clones carregam a mutação desejada e que não aquelas.

O método de rastreamento usando a digestão restrição funciona muito bem. No entanto, você deve confirmar a sua mutação bem sucedida por seqüenciamento.

Mutagênese dirigida local é um método de mutagênese, que fornece uma maneira rápida de mutação de um gene transportado por um plasmídeo. A reação geral pode ser feito em apenas um dia. Com este método, ele vai precisar de apenas um par de primers complementares levando a mutações desejadas e uma revisão da polimerase como Pfu Polimerase. O plasmídeo recém-sintetizado pode ser separado do plasmídeo parental por digerir a reação com o DpnI enzima de restrição. Esta enzima digere apenas o DNA metilado. Portanto, apenas o plasmídeo recém-sintetizado pode ser transformado. Neste tutorial nós demonstramos realizando uma mutagênese sítio dirigida utilizando um kit mutagênese caseiro. A vantagem deste kit é a redução de custos, enquanto a eficácia permanece. Os pontos críticos desse método são o desenho de primers e temperatura de recozimento. No caso do DNA recentemente sintetizado não podem ser visualizados após eletroforese, que pode indicar a falha do método, pode-se tentar precipitar a reação de todo e usá-lo para a transformação em bactérias. No entanto, a melhor maneira de resolver este problema é tentar otimizar a temperatura de recozimento ou aumentar o comprimento da região constante no primers. Além disso, usando uma polimerase de alta qualidade ou enzima de restrição também pode melhorar a sensibilidade da reação. As células competentes também são um fator-chave que os efeitos da successfulness deste método. Portanto média (107 DNA ufc / g) ou muito (109 DNA ufc / g) As células competentes são preferíveis.

Embora neste tutorial nós não demonstramos a exclusão ou inserção usando o kit caseiro, fomos bem sucedidos para fazer estas em nosso laboratório. Fomos capazes de conseguem substituir, inserir ou eliminar, pelo menos, 3 bases ao mesmo tempo.