Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Principio del método:

El sitio de mutagénesis dirigida de los plásmidos todo se explica en este video es un método de mutagénesis que le permite modificar un gen diana clonado por sustitución, supresión o inserción de unas cuantas bases directamente en un plásmido. Funciona mediante la amplificación de todo el plásmido, en una reacción de termociclado no basados ​​en la PCR. Durante la reacción de primers mutagénicos, portadores de la mutación deseada en forma de desajustes en el plásmido original, se integran en el plásmido de nueva síntesis. Después de la eliminación de la plásmido original de la reacción del plásmido mutado se transforma en E. coli. Los siguientes pasos son sólo para propósitos de revisión, porque la eficiencia de la mutación de este método no es 100%. Todo el procedimiento dura tres días, pero la parte principal se puede hacer en un día.

1.0 Primer día:

1.1 reacción termociclado:

Plásmido original: Este sitio de mutagénesis dirigida protocolo funciona mejor con plásmidos de hasta 10kb. Los plásmidos son más grandes un poco difícil de mutar con este método y puede tomar un poco de paciencia y ajuste de las condiciones de ciclos térmicos y / o las células competentes. Además, el plásmido que se trabaja con debe estar aislado de una presa + cepa de bacterias. Para la reacción de termociclado tendrá 10 a 60 ngs del plásmido desea mutar.

Cebadores: Antes de que pueda configurar su reacción termociclado usted tiene que tener su primers en la mano. Usted necesita cerca de 150 ng de cada cebador mutagénico. Esta bien, si se toma 1,5 l de una 1:10 pm 100 acciones diluidas. Hay algunas pautas sencillas que usted debe considerar al diseñar su primers mutagénicos:

• Los cebadores deben ser complementarias entre sí
• Los primers debe estar entre 25 y 45 nucleótidos de longitud
• Las mutaciones en la forma de los desajustes que el plásmido original debe estar contenido en los dos primers
• Los desajustes se deben centrar en el primer y flanqueado por al menos 8 nucleótidos en cada lado
• Los primers deben tener un contenido de GC de al menos 40%
• Los primers debe terminar cinco prime y prime 3 con uno o más Gs o C
• Los primers no necesitan ser fosforilados, ni tampoco tienen que ser purificados o FPLC PAGE, simplemente desalinizada debe ser.
• Para el cálculo de Tm no necesita ninguna fórmula, pero Tm en el certificado de envío debe ser superior a 60 ° C.
• Para fines de selección es práctico para insertar o eliminar un sitio de restricción con la mutación. Debido a la degeneración del código genético hay muchas posibilidades para insertar un sitio de restricción con la mutación deseada. El sitio web de la Nueva Inglaterra Biolabs ofrece una herramienta para encontrar ese sitio de restricción apropiadas. Simplemente introduzca su primer secuencia de codificación de la secuencia de aminoácidos que desee, utilizando el código de la ambigüedad de ADN. La herramienta de búsqueda de la enzima le dirá que los sitios de restricción se pueden introducir en paralelo a la mutación deseada. Si usted no puede encontrar ningún sitio de restricción posible o práctico de esta manera, usted puede insertar cualquier nuevo sitio de restricción sin importar el código genético en el sitio de la mutación. A partir de entonces puede utilizar este plásmido como molde para una serie de mutaciones en el que se elimina la restricción de este sitio de la inserción de los primers mutagénicos nuevo. Este enfoque puede ser muy conveniente si usted está planeando hacer una serie de mutaciones en el mismo sitio del plásmido.

ADN-polimerasa: Para este método se necesita un ADN-polimerasa termoestable que exhibe 3'-5 'exonucleasa y crea extremos romos. Siempre usamos Pfu recombinante de la polimerasa de Fermentas. Si tienes problemas con los pasos de amplificación puede probar con una polimerasa de alta calidad, pero para la mayoría de los Pfu estándar será suficiente. Completar la reacción de la polimerasa con buffer de dNTPs, y el agua.

1.2 Condiciones de termociclado

El termociclador debe establecerse de la siguiente manera. La fase de desnaturalización inicial y recurrente está establecido en 30 segundos a 95 ° C.

La temperatura de hibridación de los primers no deben ser calculados con fórmulas complicadas. Por lo general, ajustar la temperatura de recocido a 55 ° C y el tiempo de recocido a un minuto. Para los primers de 25 a 30 nucleótidos que va a utilizar en su mayoría, esto funciona para nosotros el 95% del tiempo. De todos modos, si esto no funciona, simplemente tratar de variar la temperatura de hibridación entre el 50 - y 60 ° C.

La temperatura depende de la elongación de la polimerasa que utiliza. En esta demostración se utiliza el PFU-polimerasa de Fermentas, que llama a una temperatura de elongación de 72 ° C. El tiempo de elongación varía según el tamaño del plásmido. Siempre calculamos 1 minuto por cada kb, y añadir un minuto adicional para quetiempo. Por ejemplo, un plásmido 9kb nos volveríamos a elegir 10 minutos como tiempo de elongación.

18 ciclos son suficientes para crear suficiente plásmido mutado para el uso posterior. Mantener el número de ciclos de baja, también le ahorra tiempo.

1.3 Gelcheck después de la reacción termociclado

La amplificación de éxito debe ser revisado por la realización de una electroforesis. Inmediatamente después de la bicicleta ha terminado, carga de 5 l de la reacción en un 1% en gel de agarosa TAE. Si la ampliación se ha realizado correctamente, debería ver una banda distinta. Sin embargo, si la nueva síntesis de ADN no es claramente visible en el gel, se puede tratar de precipitar la reacción de todo y lo utilizan para la transformación en el siguiente paso. Para nosotros, esto rara vez ha trabajado, pero vale la pena darle una oportunidad. Lo mejor que puedes hacer si la reacción no funciona es para ajustar la temperatura de recocido.

1.4 DpnI la digestión:

Antes de la transformación del plásmido original que sirvió de plantilla debe ser removido de la reacción para evitar que gran experiencia. Esto se realiza mediante digestión de restricción con DpnI. Esta endonucleasa de restricción corta sólo metiladas plásmido. Su reconocimiento y su sitio de restricción es la secuencia GATC, mientras que A tiene que ser desnaturalizado. Durante la digestión con DpnI sólo el plásmido originales sin mutación que fue aislado de una presa + tensión se corta, el plásmido mutado nueva síntesis que no está metilado no se ve afectada por DpnI. Sólo tienes que añadir 2.1 l de DpnI a la reacción e incubar por lo menos una hora a 37 °. Cuando se utiliza el ayuno DpnI digerir el tiempo de incubación puede ser reducida a unos 15 minutos. La calidad de su DpnI y el tiempo de incubación de esta restricción de la digestión en gran medida determina la fortaleza de su fondo con el plásmido sin mutación será.

1.5 Transformación:

Después de la digestión del plásmido DpnI está listo para su transformación en las autoridades competentes E. células de E. coli. Sólo tienes que añadir 5 l de la reacción de digestión DpnI en las células competentes y llevar a cabo la transformación como se recomienda en su laboratorio. En nuestro caso usamos el procedimiento de golpe de calor mediante la incubación de la mezcla de bacterias plásmido en hielo durante 30 minutos y después de choque térmico es de 42 ° C durante 90 segundos. Después de la adición de 200 l SOC-solución, las bacterias se incuban, sacudiendo vigorosamente, a 37 ° C durante 1 h. Después de 1 hora la bacteria se colocan en la selección de los medios de agar.

2.0 El segundo día

2.1 Detección de clones parte 1: Selección de los clones

Debido a que la eficiencia de la mutación no es 100% que necesita para la detección de su mutantes. Hacemos esto por restricción de la digestión en el que se comprueba la presencia o ausencia del sitio de restricción que se agregan o eliminan mediante la integración de imprimación. Para ello se suelen recoger ocho colonias y hacerlas crecer durante la noche para la preparación de plásmido al día siguiente.

3.0 El tercer día

3.1 Detección de clones parte 2: restricción de la digestión con la enzima marcador

En el tercer día se realiza una preparación Mini y restricción de la digestión posterior con el marcador de la enzima. En el gel que se puede ver que uno de sus clones portadores de la mutación deseada y cuáles no.

El método de detección sistemática mediante restricción de la digestión funciona muy bien. Sin embargo, usted debe confirmar la mutación del éxito de la secuenciación.

Mutagénesis dirigida es un método de mutagénesis, que proporciona una forma rápida de mutar un gen transportado por un plásmido. La reacción general se puede hacer en un solo día. Con este método, sólo necesitará un par de cebadores de cortesía llevar a las mutaciones deseadas y una revisión de la polimerasa como PFU-polimerasa. El plásmido de nueva síntesis se puede separar de los padres plásmido por digestión de la reacción con la enzima de restricción DpnI. Esta enzima digiere sólo el ADN metilado. Por lo tanto, sólo el plásmido de nueva síntesis se puede transformar. En este tutorial vamos a demostrar la realización de una mutagénesis dirigida mediante el uso de un kit de mutagénesis en casa. La ventaja de este kit es el ahorro de costes, mientras que la eficacia se mantiene. Los puntos críticos de este método son el primer diseño y la temperatura de recocido. En el caso de la nueva síntesis de ADN no se puede visualizar después de la electroforesis, que puede indicar el fracaso del método, se puede tratar de precipitar la reacción de todo y lo utilizan para la transformación de las bacterias. Sin embargo, la mejor manera de resolver este problema es tratar de optimizar la temperatura de hibridación o aumentar la longitud de la región constante de los cebadores. Además, usando una polimerasa de alta calidad o de enzimas de restricción también puede mejorar la sensibilidad de la reacción. Las células competentes también son un factor clave que afecta la successfulness de este método. Por lo tanto, las células de media (107 ADN ufc / g) o muy (109 ADN ufc / g) son preferibles competente.

Aunque en este tutorial no demostró la supresión o inserción utilizando el kit en casa, hemos tenido éxito en hacer esto en nuestro laboratorio. Hemos sido capaces de sustituir con éxito, insertar o borrar por lo menos tres bases al mismo tiempo.