Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Parte 1: Prepare soluções eo sistema de coração isolado perfundido

1. Na manhã do experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit está preparado como descrito anteriormente ^{[5, 6].}
2. 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) é dissolvido em 1,0 L de Krebs-Henseleit decantado do perfusato preparada no passo 1.1.
3. Um adicional de 150 mL de Krebs-Henseleit é removido do perfusato preparada no passo 1.1 e misturado com 5 Mol / L di-8-ANEPPS (diluído a partir de um estoque 10 mMol / L dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO)).
4. Estas três soluções são transferidos para com camisa de água de vidro reservatórios (Radnoti), onde são pré-aquecido a 41,0 ° C e oxigenada com um borbulhador submersa (Radnoti) com 0,2 m filtrada 95% O _2, 5% do gás CO _2. Soluções a partir de 3 reservatórios de ações são bombeados para o sistema de Langendorff parede com Masterflex ™ L / S bombas peristálticas e de baixa absorção de tubo de silicone (Cole-Parmer).
5. Antes da montagem, o sistema de Langendorff vidro (Radnoti) é meticulosamente lavados com E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e bem enxaguadas com 0,1 M / L HCl, 100% de etanol, e água destilada.
6. O não-recirculação Langendorff aparelho foi construído para entregar 70 mm Hg a pressão constante de 3 reservatórios separados oxigenados, que são separados a partir do coração com bobinas de jaqueta de água de aquecimento e armadilhas bolha (Radnoti) ^[7]. As 3 linhas de perfusão independente convergem acima do coração, duas torneiras de 3 vias, permitindo-nos controlar com precisão a entrega das soluções preparadas em passos 1,1-1,3. Jaqueta de água de vidro é ligado em série com Masterflex tubulação BPT Pharmed (Cole-Parmer) e aquecida a 39 ° C com água destilada usando dois circuladores E100 (Lauda). Perda de calor através do tubo de silicone de platina curado (Cole-Parmer) que conecta os reservatórios de pressão de cabeça para as bobinas de aquecimento e armadilhas bolha resultou em um 37 ° C perfusato atingindo o coração.

Parte 2: Colheita do coração de rato e set-up de perfusão Langendorff

1. Para induzir a anestesia geral profunda em ratos Lewis 200-250 g, 100 mg cetamina / kg e 10 Xilazina mg / kg é injetado na cavidade intraperitoneal. Para esta mistura, acrescentamos 500 Heparina U / kg para evitar a coagulação do sangue e isquemia miocárdica durante o procedimento de remoção.
2. Para fácil acesso ao coração e grandes vasos, parede anterior do tórax é removido. Depois disso, o tecido circundante é cuidadosamente dissecados e do saco pericárdico aberto.
3. Após a identificação da veia cava inferior, esta embarcação é ligada com seda 5-0 (Ethicon) eo bloco coração-pulmão inteiro é explantado. Tecido é colocado imediatamente em solução gelada Krebs-Henseleit contida em um copo de 50 mL no gelo.
4. A aorta ascendente é rapidamente identificado e dissecado do tecido circundante. Uma cânula de tamanho apropriado (Harvard Apparatus) é inserido na aorta, tendo o cuidado de evitar a interrupção da perfusão obrigatória das artérias coronárias através da inserção da cânula muito longe na raiz da aorta. A cânula é fixada à aorta ascendente com seda 5-0 (Ethicon).
5. O coração de rato é então colocada sobre o aparelho Langendorff sem a introdução de bolhas de ar na cânula. Perfusão coronária retrógrada vascular é agora estabelecida com a quente, oxigenada solução de Krebs-Henseleit a partir da pressão de cabeça descrito no passo 1.6.
6. Tecido extra, incluindo os pulmões, é removido eo coração é perfundidos por 20 minutos para permitir a recuperação da função e estabilizar o ritmo. Durante este tempo, uma sonda de temperatura muito fino termopar (Cole-Parmer) é introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e suturado no lugar com Prolene 5-0 sutura (Ethicon). A sonda é ligada a um termo-controlador (Digi-Sense) para garantir a temperatura do coração é mantida a 37 ° C, ajustando as configurações das bombas de circulação de água. Movimento de perfusato pingando do ápice cardíaco é minimizado pela colocação de um pedaço de gaze no receptáculo de efluentes.

Parte 3: coração de carga com corante potenciométrica e adquirir sinais eletrográficos e óptica

1. Di-8-ANEPPS (Invitrogen) é carregado para o coração, alternando para a linha de perfusão que contém a mistura de Krebs-Henseleit com o corante fluorescente usando uma torneira. Além disso, uma cânula de 18G é colocado no átrio esquerdo e / ou para a direita e de 50 mL de solução corante adicional é administrado lentamente em cada uma destas câmaras, porque eles não são suficientemente perfundidos com corante introduzido através das artérias coronárias.
2. Durante o procedimento de carga, três derivações (Harvard Apparatus) são delicadamente colocados sobre a superfície do coração que não está enfrentando a ótica utilizada para o mapeamento. Eletrodo N ^o 1 está posicionado na parte posterior apical do ventrículo esquerdo, ^o N 2 no átrio esquerdo, e N p> O 3 como um eletrodo de referência na raiz da aorta (Figura 1). Os sinais eletrocardiográficos atriais e ventriculares são posteriormente amplificada, digitalizada e exibida ao lado de sinais ópticos usando o software (redshirt Imaging) (Figura 2). Um osciloscópio (Tektronix modelo TDS 1002) também é usado para visualizar a superfície ECG s em tempo real e assegurar a estimulação adequada.
3. ECG amplificador (Hugo Sachs Elektronik) configurações: filtro passa-alto: 0,1 Hz
   Filtro passa-baixa: 150 Hz
4. A câmera CMOS (redshirt Imaging) e macroscópio é posicionado usando os ajustes XYZ modo que a superfície do coração está em foco e centrado no quadro de aquisição. A câmara óptica e são montados em uma mesa de isolamento de vibração (Minus K Technology) para minimizar as freqüências de ressonância. Ao mesmo tempo, um eletrodo de marcapasso coaxial (Harvard Apparatus) controlada com um isolado, S48 unidade de estimulação elétrica (Grass), é colocado no átrio direito eo coração está acelerado a 300 batimentos por minuto (Figura 1).
5. Estimulação elétrica (Grass) configurações:
   Taxa: 5 pulsos por segundo
   Delay: 0,2 ms
   Duração: 2 ms
   Volts: 6-12 V
   Modo: Repetir
   Pulso: Single
6. Para gravações óptico que falta artefatos de movimento de contração, o coração precisa ser desacoplado eletromecânica. Fazemos isso de novo comutação de linhas de perfusão de Krebs-Henseleit solução que contém 11 mmol / L BDM. Entre as aquisições, o coração é puro perfundidos com Krebs-Henseleit para ajudar a preservar a viabilidade da preparação.
7. Os parâmetros de gravação são definidos usando o software (Imaging redshirt) com as configurações de aquisição seguintes:
   Configuração: 2.000 Hz; 128x128 matriz de pixels
   Intervalo de quadro: 0,5 ms
   Ganho câmera Amplificador: 5x
   On-Chip Gain: 8x-12Me bem-
   Obturador: 500 ms de atraso
   Número de Frames: 4000
   Duração: 2000 ms
8. Todas as luzes da sala e equipamentos estão desligados ou blindado para eliminar o ruído de fundo durante a gravação. A luz LED ilumina o coração só durante a gravação óptica para reduzir a foto-branqueamento e toxicidade de corantes. O obturador fonte de luz é controlada com um pulso de 5 V entregue através do painel de controle por meio de uma D-to-Uma placa no computador (Imaging redshirt).

Parte 4: Analisar as informações de aquisição utilizando Software Imaging redshirt

1. Após a aquisição, os dados são processados ​​utilizando-se diferentes configurações do filtro. Em geral, usar as configurações padrão, exceto quando se ajusta a Banda Stop / Passe filtro, que é definido com o limite à esquerda em 44,0 e no limite direito a 98,0. Depois as informações gravadas são processados ​​e um filme é gerado (Imaging redshirt).
2. Dados de uma aquisição corresponde à ativação local elétrica em 16.384 sites na superfície do coração durante um período de 2 segundos. O software permite que estes sinais locais para ser diretamente comparados entre si e com as gravações atriais e ventriculares eletrográfico. Dados são então visualizados através do mapeamento de ativação elétrica local a cor e tornando esta informação como uma animação mostrando a ativação espaço-temporal elétrica na superfície cardíaca. Para criar tal uma animação, usamos o software para:
   • temporal e / ou filtrar os dados espacialmente
   • selecionar um tempo de início e término para a animação
   • sinais ópticos para mapa de cores com base na intensidade da luz de descanso de cada pixel
   • sobrepor os dados de cor resultante com uma imagem do coração
   • gerar a animação

Parte 5: Os resultados representativos

Se a preparação do coração perfundido estava imóvel durante a gravação, o sinais ópticos mostram um pico distinto para cada pixel envolvido em uma mudança da intensidade de emissão de di-8-ANEPPS. Os filmes correspondentes (Figuras 3 e 4) demonstram uma frente de onda de excitação propagação em toda a superfície epicárdica do coração, assim como as gravações simultaneamente adquiridas eletrocardiográfico (Figura 2).

Figura 1. Uma fotografia de uma preparação de coração Langendorff-perfundidos representando as posições do eletrodo de marcapasso em átrio direito e do ECG, como descrito no passo 3.2.

Figura 2. Representante sinais ópticos e gravações eletrocardiográfico de um coração de rato perfundido Lewis. Um painel mostra uma imagem da superfície epicárdica utilizado para geração de imagens ópticas. A posição dos pixels selecionados para demonstrar as mudanças na emissão de fluorescência ao longo do tempo no Painel B são indicadas por setas coloridas. Sinais eletrográficos são mostrados no painel C com a linha vermelha que indica a ativação atrial ea linha de luz azul correspondente ao sinal ventricular. Por favorve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Remoção do coração de ratos anestesiados deve ser realizada rapidamente para evitar a isquemia miocárdica. Se isquemia ou insuficiente perfusão coronária ocorre, o coração provavelmente irá desenvolver arritmias e pode tornar-se infartado. Além disso, esses corações irá mostrar emissão de fluorescência insuficiente para gravações informativo e análises subseqüentes. Antes de colocar o corante, as células do miocárdio têm de ser adequadamente perfundidos com Krebs-Henseleit para estabelecer e manter um ambiente eletrolítico fisiológico para a estabilidade de impulsos elétricos. Preparação precisa do perfusato é também necessário para manter a viabilidade do órgão ea função. Diferenças na concentração de eletrólitos ou filtragem insuficiente do perfusato provavelmente levará a disfunção miocárdica fatal e distúrbios do ritmo cardíaco. Para as gravações ópticas, o coração deve ser completamente carregado com sensíveis à voltagem corante. Isto é especialmente importante para o miocárdio atrial como estas câmaras não são bem perfundidos por artérias coronárias. Nós descobrimos que a perfusão intra-cavitárias adicionais dos átrios vai estabelecer um bom sinal óptico. Além disso, a aquisição dos traçados de alta qualidade tensão exige o coração perfundido de ser imóvel, caso contrário, as mudanças na emissão de fluorescência não pode ser confiavelmente utilizado para controlar as alterações no potencial de membrana com alta fidelidade, devido a artefatos causados ​​por desvio de sinal. Isto irá resultar em picos múltiplos para um pixel ao invés de um único pico. Outros métodos para eliminar artefatos de movimento a partir de gravações ópticas incluem imobilização mecânica, tratamento com outros excitação-contração desacopladores (por exemplo, citocalasina D, blebbistatin), processamento de sinal, e por modelagem matemática ^{[1, 8].} Finalmente, o método aqui descrito fornece apenas informações sobre o movimento do potencial de ação na superfície epicárdica cardíaca. Preparações de tecidos alternativos e infravermelho corantes potenciométrica pode resolver as características de propagação elétrica em outras regiões do coração.