Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты

Экспериментальных процедур

Экспериментальная процедура состоит из двух основных частей, описанных в шаге мудрым образом ниже.

Часть 1: ПОДГОТОВКА ГИППОКАМПА астроцитов КУЛЬТУР

Короче говоря, смешанные гиппокампа астроцитов-нейрона культуры были подготовлены с использованием хорошо установленным протоколом ^1,2,3. Мы оптимизировали процедуру для получения здорового культурного астроцитов. Все процедуры, перечисленные ниже, должны осуществляться в стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.

Подготовка покровных

• 22 мм покровные (VWR, 48380-068)
• Поли-D-лизин (PDL, Sigma P0899), аликвоты (1 мг / мл)
• Ламинин аликвоты (20 мкг / мл): добавить 49 мл стерильной воды до 1 мг / мл ламинин решение (Sigma L2020), убедитесь, 1,2 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C

1. Растворите PDL в стерильной воде (50 мкг / мл)
2. Автоклав покровные, промыть стерильной водой и поместите в PDL (20 мл на 100 покровные). Оставить при комнатной температуре в течение ночи.
3. Замените PDL стерильной водой (3 обширные моет). Затем сухие покровные и хранить при температуре 4 ° C.
4. Накануне покрытие астроциты, место отдельных покровных в стерильных также на 6-луночного планшета (многоямного плоским дном пластины с крышками, стерильные с BD Bioscience). Положите 400 мкл ламинин на каждом покровное и инкубировать в течение ночи, в инкубаторе, чтобы избежать испарения.

Рассечение

Препарирование СМИ:

• Сбалансированный 500 мл Эрла раствор соли (EBSS) (1X), жидкие (Invitrogen, 14155-063)
• 5 мл HEPES решение (Sigma, H0887)

Гиппокампа СМИ:

• 412,5 мл минимально необходимого среднего (MEM) (1X), жидкость содержит солей Эрла, но не L-глютамин или фенол красный (Invitrogen, 51200-038)
• 10 мл глюкозы (Sigma, D-(+)-ГЛЮКОЗЫ БЕЗВОДНЫЙ SIGMA ULTRA G7528) 1 M в MEM
• 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
• 5 мл Натрия пируват решение (Sigma, S8636)
• 12,5 мл HEPES раствор 1 М (Sigma, H0887)
• 5 мл N-2 Дополнение (100X), жидкие (Invitrogen, 17502-048)
• 50 мл лошадиной сыворотки, тепло-инактивированная (Invitrogen, 26050-088)

Папаин решение:

• Добавьте 5 мл вскрытия средств массовой информации в Уортингтон папаин-022 флакона (LK003178; конечная концентрация 20 ЕД / мл) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.

1. Обезглавьте крысят в возрасте P1 (обычно 2 щенка) следующие рекомендации проверены и одобрены национальными правилами и ваши местные институциональные уходу и использованию животных комитета.
2. Удалить кожу и череп и мозг место в чашке Петри заполнены холодной СМИ рассечение.
3. Удалены мозговых оболочек, рассекать обоих полушарий и рассекать гиппокампе.
4. Чоп в гиппокампе ~ 1X1 мм кусочки и переварить в растворе папаина при 37 ° С в течение 11-13 мин.
5. Как только кусочки ткани осели, удалить папаин осторожно и добавляют 5 мл гиппокампа среду, чтобы удалить все следы фермента. Повторите этот шаг и ресуспендируют в гиппокампе среде (2 мл).
6. Измельченного в порошок клетки ~ 5 раз, пока Есть не сгустки слева, с тремя пламени полированный пипеток все меньшие отверстия (1000 мкм, ~ 500 мкм и ~ 300 мкм).
7. После растирают, проходят клетки через ячейки сетчатого фильтра (размер пор, 70 мкм, BD Bioscience). Граф клеток в 10 мкл суспензии. Регулировка громкости гиппокампа средой, чтобы иметь 400 000 клеток / мл.
8. Аспирируйте ламинин от покровных, а до крышки можно сухих, пластина 200 мкл суспензии клеток в покровное.
9. Оставьте их приложить в течение 60 мин в инкубаторе, а затем добавить 2 мл гиппокампа среды на лунку.
10. На следующий день, аспирации старые гиппокампа средой для удаления мертвых клеток и мусора и добавьте 2 мл подогретого свежего гиппокампа среды.

Обслуживание

Neurobasal СМИ:

• 500 мл neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
• 10 мл сыворотки B27 бесплатное приложение (Invitrogen, 17504-044)
• 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
• 1,25 мл L-глутамина (Invitrogen, 25030-149)

Поток астроцитов-нейрон культур два раза в неделю с neurobasal среды, начиная через четыре дня после металлизации. Preincubate СМИ около 30 минут в инкубаторе в вентилируемом колбу, чтобы уравновесить температуру и CO _2.

Часть 2: КАЛЬЦИЯ IMAGING

Гиппокампа буфера записи: 110 мМ NaCl, 5,4 мМKCl, 1,8 мМ CaCl _2, 0,8 мМ MgCl _2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES (Все химические вещества из Sigma), рН 7,4 (регулируется с NaOH).

Загрузка красителя кальция индикатор в астроциты

1. Место культуры в хорошо на 6-луночный планшет заполнен 2 мл гиппокампа буфера записи, содержащей 2,5 мкМ Fluo-4, А. М. (Invitrogen, F-14217) и 0,05% Pluronic ® F-127 20% раствор в ДМСО (Invitrogen, P-3000MP) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-30 мин.
2. Удалить Fluo-4 решения и мыть покровные 3 раза гиппокампа буфера записи и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
3. Место покровное на камеру, а чистая другой стороне покровного с объективом жидкости очистки.
4. Положите одну каплю иммерсионного масла (погружение нефти типа DF с Cargille) на цель и поставить камеры (с открытой камерой на 25 мм выстрел покровное от Warner Instruments) на столик микроскопа (Olympus IX71).
5. Посмотрите на клетки, используя пропускание света, чтобы увидеть, как выглядят клетки, и получить их в фокусе. Затем освещения клеток с 488 нм от монохроматора (полихромные V от до Vision) и определить, если сигнал флуоресценции от Fluo-4 является однородным и обнаруживается в астроциты.
6. Используйте РПИ и TIRF освещения для измерения кальция в астроциты.

TIRF микроскопии

Одним словом, мы используем Olympus IX71 Микроскоп оснащен камерой Andor IXON DV887DCS EMCCD. Контроль возбуждения и захвата изображений достигается с помощью TILLVision программного обеспечения. Пучки 454/488/515 нм аргон (100 мВт) и 442 нм твердом состоянии (45 мВт) лазеры и управляться с ДО Polyline лазерной комбайнера, TIRF двойной конденсатор порт и acoustoptical настраиваемый фильтр и контроллер (AOTF, все из ДО Photonics) и подается в Kineflex широкие волокна полосы для вступления в конденсаторе TIRF. Мы используем Olympus 60X 1,45 NA линз для достижения TIRF. Усиление камеры настраивается для каждого астроцитов, чтобы обеспечить лучший сигнал-шум изображения. Фон и принципы микроскопии TIRF были недавно рассмотрели ^{4, 5.} Большинство оптических компонентов мы используем были приобретены у ДО Photonics, которая сейчас является частью компании Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Глубина проникновения МДП может быть рассчитана по уравнениям ниже.

D = глубина проникновения

n1 = преломления стекла

n2 = преломления клеточных

= угол падения

NAi = числовой апертурой падения

В целях обеспечения лазерной выравнивается оптимально для TIRF мы находим его полезным для наблюдения 100 нм флуоресцентного шарик (Invitrogen, F8803). Мы представляем отдельные кадры и видео из бисера с РПИ и TIRF микроскопии. Когда в TIRF, наблюдается резкое увеличение сигнал-шум и бисером дисплей броуновской диффузии. Мы находим его полезным для наблюдения за поведением 100 нм бисер с TIRF микроскопии на регулярной основе (~ раз в неделю), чтобы убедиться, что оптимальное TIRF происходит, а не угрозу косом освещении, что может произойти, если критический угол не были равны α (см. рис 1).

Применение G-белком рецептор агонистов связаны

Астроциты выражать различные Gq-связанных рецепторов, ^{6, 7,} включая метаботропных рецепторы глутамата и P2Y рецепторов (агонист, АТФ, АДФ). Активация этих рецепторов приводит к значительному увеличению внутриклеточного уровня кальция в астроциты. Например, нетрудно заметить внутриклеточного кальция высотах во время применения СПС (30 мкМ) на астроциты ^8-10. Мы используем быстрое решение переключатель с Warner инструменты называют VC-77SP Быстро Шаг перфузии системы (http://www.warneronline.com/index.cfm). С помощью этого метода решения могут быть применены в менее ~ 10 мс.

Рисунок 1. Мультфильм и фотографии изображений создана. А. Показывает фотографию Микроскоп установлен на airtable, в то время (B) показывает фотографию лазерной установки, контроллеры и балки коробки. С. Показывает фотографию столике микроскопа с камеры установлены для работы с изображениями. На левом быстро устройство перфузии можно увидеть (наряду с шаговым двигателем и тета трубки). На правом headstage из усилителя Axopatch 200A не наблюдается. Мультфильм схематизирует пути света в настройке и как TМДФ достигается. Лазерной сосредоточено на задней фокальной плоскости 60X 1,45 NA объектива и его положение регулируется от центра так, что он возникает в иммерсионного масла в критический угол α. В этот момент луч испытывает полное внутреннее отражение и убывает с расстоянием λ (см. уравнение в основной текст) в среду меньшим показателем преломления. В данном случае это буфер записи окружающие астроциты и астроциты себя. В результате оптического возбуждения (и, следовательно, изображения) молекул с точностью до ~ 100 нм от плазматической мембраны. В мультфильме ячейки это показано в виде зеленых "возбужденным" мембранных рецепторов, тогда как в клетке или на верхней поверхности клетки не возбуждаются. Полный отчет о микроскопии TIRF была предоставлена ​​Steyer и Алмерс ^4.

Рисунок 2. Изображения 100 нм люминесцентные бусины, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. показывает EPI изображения поля зрения с несколькими десятками 100 нм флуоресцентные бусы. Красная точка стрелки бусы, которые поселились на стекло покровное, тогда как синие стрелки указывают на бусы, которые диффундируют в воде. Б. Шоу TIRF изображение одного и того же поля зрения, как показано на А. С этой точки зрения только приверженец бисером показаны красными стрелками видны. Это потому, что эти поселились на стекло coverlsip и, таким образом в течение ~ 100 нм затухающего поля. Бисер показано в по синим стрелкам, не в этом регионе и, таким образом, невидимые на изображениях TIRF. Ниже графики показывают 3D-рендеринга образов. Очевидно, что значительное увеличение отношения сигнал-шум происходит для бисера в затухающего поля при наблюдении с помощью микроскопии TIRF. На самом деле за этими изображениями сигнал-шум для РПИ составила 7,1 ± 0,6, тогда как для TIRF было 20 ± 0,7.

Рисунок 3. Изображения астроциты загружены Fluo-4 кальция индикатор красителя, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. EPI изображения поля зрения с пятью астроцитов. Б. изображение TIRF одного и того же поля зрения показано на В. Отметим, что образы в А и В существенно различаются. Это потому что с TIRF освещения только плазматической мембраны регионах в тесном прикладывание к покровное стекло в образ будут включены. Нижней панели показывают АТФ-вызвали внутриклеточного кальция переходных полученную с РПИ и TIRF микроскопии.

Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов ^11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклеточного кальция высоты может вызвать высвобождение сигнальных молекул, которые активируют рецепторы нейронов на ^{11, 12.} Это спорный, потому что было доказательств за и против этой точки зрения, как это подчеркивается в обзорах Хейдон ^{7, 13} и Маккарти ¹¹ лабораторий. Исходя из наших последних изображений срез мозга и электрофизиологических данных, мы утверждали, что лучше и точное понимание динамики астроцитов кальция необходимо прежде, чем новые на базе гипотезы эксперименты могут быть разработаны для определения того, как нейроны, астроциты воздействия ^14. В этом видео статье мы представляем простой способ изображения вблизи плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно в культуре астроцитов. Неизбежные технические требования микроскопии TIRF в том, что культивируемые клетки должны быть использованы, поскольку они придерживаются стекло покровное в затухающих глубины поля ^3. Стоит отметить, что астроциты в культуре изменить свои профили экспрессии генов по сравнению с теми в естественных условиях ^15, и поэтому этот нюанс следует учитывать при реализации этого метода. При этом рассмотрение в виду, однако простой метод мы доклад не позволяют изображения и количественно около плазматической мембраны и глобальные изменения внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее применение подхода к астроциты обещает предоставление точных данных о внутриклеточные изменения кальция вблизи плазменной оболочки астроцитов. Наличие таких количественных данных будет полезна для полного понимания астроцитов биологии.