Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

Experimentelle Verfahren

Das experimentelle Verfahren besteht aus zwei wichtigen Teilen, die in einem Schritt weise Weise beschrieben werden.

Teil 1: Vorbereiten des Hippocampus Astrozyten KULTUREN

Kurz gesagt wurden gemischt Hippocampus Astrozyten-Neuron Kulturen hergestellt unter Verwendung eines etablierten Protokoll ^1,2,3. Wir optimieren das Verfahren zur gesunden kultivierten Astrozyten zu erhalten. Alle unten aufgeführten Schritte sollten in einer sterilen Umgebung wie einer Sterilbank durchgeführt werden.

Vorbereitung Deckgläser

• 22 mm Deckgläser (VWR, 48380-068)
• Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P0899), Aliquots (1 mg / ml)
• Laminin Aliquots (20 ug / ml): add 49 ml sterilem Wasser zu 1 mg / ml Laminin-Lösung (Sigma L2020) machen 1,2 ml aliquotiert und bei -20 ° C

1. Lösen PDL in sterilem Wasser (50 ug / ml)
2. Autoclave die Deckgläser mit sterilem Wasser und in PDL (20 ml für 100 Deckgläser) spülen. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
3. Ersetzen PDL mit sterilem Wasser (3 umfangreiche Waschgänge). Dann trocknen die Deckgläser und lagern bei 4 ° C.
4. Am Tag vor dem Ausplattieren der Astrozyten, statt einzelner Deckgläser in einer sterilen auch auf einer 6-well-Platte (Multiwell Flat-Bottom Platten mit Deckel, steril aus BD Bioscience). Legen Sie 400 ul von Laminin auf jedem Deckglas beimpft und über Nacht, in den Inkubator, um Verdunstung zu vermeiden.

Zergliederung

Dissection Medien:

• 500 ml Earle Balanced Salt Solution (EBSS) (1x), flüssig (Invitrogen, 14155-063)
• 5 ml HEPES-Lösung (Sigma, H0887)

Hippocampus Medien:

• 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1x), flüssig Enthält Earle-Salzen, aber kein L-Glutamin oder Phenolrot (Invitrogen, 51200-038)
• 10 ml Glucose (Sigma, D-(+)-Glucose wasserfrei SIGMA ULTRA G7528) 1 M in MEM
• 5 ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122)
• 5 ml Natriumpyruvat-Lösung (Sigma, S8636)
• 12,5 ml HEPES-Lösung 1 M (Sigma, H0887)
• 5 ml N-2 Supplement (100x), flüssig (Invitrogen, 17502-048)
• 50 ml Pferdeserum, hitzeinaktiviertem (Invitrogen, 26050-088)

Papain-Lösung:

• 5 ml Dissektion Medien in Worthington PAPAIN-022 Fläschchen (LK003178; Endkonzentration 20 U / ml) und bei 37 ° C für 60 min.

1. Enthaupten Rattenbabys im Alter von P1 (typischerweise 2 Welpen) folgende Richtlinien überprüft und durch nationale Vorschriften und Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
2. Entfernen Sie Haut und Schädel und Gehirn Platz in Petrischale mit kaltem Dissektion Medien gefüllt.
3. Entfernt Meningen, sezieren beiden Hemisphären und sezieren hippocampi.
4. Hacken Sie die hippocampi in ~ 1X1 mm Stücke und verdauen in Papain-Lösung bei 37 ° C für 11-13 min.
5. Sobald die Teile des Gewebes niedergelassen haben, zu entfernen Papain sorgfältig und mit 5 ml Medium Hippocampus, um alle Spuren des Enzyms zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt und resuspendieren in Hippocampus-Medium (2 ml).
6. Man reibt die Zellen ~ 5 mal, bis keine Klumpen links, mit drei Flammen-polierten Pipetten immer kleiner Bohrungen (1000 mu m, ~ 500 um und ~ 300 Fm).
7. Sobald verrieben, pass die Zellen durch eine Zelle Sieb (Porengröße 70 um, BD Bioscience). Zählen Sie die Zellen in 10 ul Suspension. Stellen Sie die Lautstärke des Hippocampus Medium, um bis 400000 Zellen / ml haben.
8. Saugen Sie das Laminin aus dem Deckgläschen, und bevor die Abdeckungen können trocken, Platte 200 ul der Zellsuspension pro Deckglas.
9. Lassen Sie sie für 60 min in den Inkubator legen, und dann 2 ml Hippocampus Medium pro Vertiefung.
10. Am nächsten Tag absaugen alten hippokampalen Medium, um tote Zellen und Ablagerungen zu entfernen und 2 ml vorgewärmten frischen Hippocampus Medium.

Wartung

Neurobasal Medien:

• 500 ml Neurobasalmedium (Invitrogen, 12348-017)
• 10 ml Serum B27 kostenlose Beilage (Invitrogen, 17504-044)
• 5 ml Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, 15140-122)
• 1,25 ml L-Glutamin (Invitrogen, 25030-149)

Feed the Astrozyten-Neuron Kulturen zweimal pro Woche mit Neurobasalmedium ab 4 Tage nach dem Ausplattieren. Vorinkubieren den Medien über 30 min im Inkubator in einem belüfteten Kolben auf die Temperatur und CO ₂ ausgleichen.

Teil 2: Kalzium-Imaging

Hippocampus Aufzeichnungspuffer: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 mM CaCl _2, 0,8 mM MgCl _2, 10 mM D-Glucose, 10 mM HEPES (Alle Chemikalien von Sigma) pH 7,4 (eingestellt mit NaOH).

Loading Kalzium-Indikator-Farbstoff in Astrozyten

1. Legen Sie die Kultur in einem Brunnen auf einem 6-well-Platte mit 2 ml Hippocampus Aufnahme-Puffer mit 2,5 pM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) und 0,05% Pluronic ® F-127 20% ige Lösung in DMSO gefüllt (Invitrogen, P-3000MP) und bei Raumtemperatur für 10-30 min inkubieren.
2. Entfernen Fluo-4-Lösung und waschen Deckgläschen 3 mal mit Hippocampus Aufzeichnungspuffer und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
3. Legen Sie das Deckglas auf die Kammer, und reinigen Sie die andere Seite des Deckglases mit Objektiv Reinigungsflüssigkeit.
4. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Immersionsöl (Immersionsöl TYPE DF aus Cargille) auf dem Ziel und setzte Kammer (Open Kammer für 25 mm runde Deckgläschen von Warner Instruments) auf der Bühne des Mikroskops (Olympus IX71).
5. Schauen Sie sich die Zellen mit Hilfe von Durchlicht zu sehen, wie die Zellen aussehen, und sie in den Fokus. Dann leuchten die Zellen mit 488 nm aus einem Monochromator (Polychrome V von TILL Vision) und festzustellen, ob das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 ist einheitlich und nachweisbar in Astrozyten.
6. Verwenden Sie EPI und TIRF Beleuchtung Kalzium in Astrozyten zu messen.

TIRF-Mikroskopie

Kurz gesagt, werden wir eine Olympus IX71 Mikroskop mit einem Andor IXON DV887DCS EMCCD-Kamera ausgestattet. Die Kontrolle der Anregungs-und Bildaufnahme erfolgt über TILLVision Software. Die Strahlen 454/488/515 nm Argon (100 mW) und 442 nm Festkörper (45 mW) Laser werden kombiniert und gesteuert mit einem TILL Polyline Laser Kombinierer, TIRF Dual-Port-Kondensator und acoustoptical abstimmbaren Filter und Controller (AOTF, alle aus TILL Photonics) und in einen Kineflex breitbandigen Glasfaser für die Einreise in die TIRF Kondensator. Wir verwenden eine Olympus 60X 1,45 NA Objektiv TIRF erreichen. Die Kamera zu gewinnen ist für jeden Astrozyten angepasst werden, um das beste Signal-Rausch-Bilder liefern. Der Hintergrund und Prinzipien der TIRF-Mikroskopie wurden kürzlich bewertet ^{4., 5.} Die meisten der optischen Komponenten verwenden wir wurden von TILL Photonics, die jetzt Teil der Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/) erworben. Das TIR-Eindringtiefe kann aus den folgenden Gleichungen berechnet werden.

d = Eindringtiefe

n1 = Brechungsindex des Glases

n2 = Brechungsindex der Zelle

a = Einfallswinkel

NAi = numerische Apertur von Inzidenz

Um sicherzustellen, dass die Laser optimal für TIRF ausgerichtet wir finden es hilfreich, 100 nm fluoreszierende Kügelchen (Invitrogen, F8803) zu beobachten. Wir präsentieren Standbilder und Videos von Perlen mit EPI und TIRF-Mikroskopie. Wenn in TIRF, beobachtet man einen dramatischen Anstieg der Signal-Rausch-und die Perlen Display Brownschen Diffusion. Wir finden es sinnvoll, das Verhalten von 100 nm Perlen mit TIRF-Mikroskopie in regelmäßigen Abständen (~ einmal pro Woche), um sicherzustellen, dass eine optimale TIRF, tritt anstelle des kompromittierten Schrägbeleuchtung dass auftreten würden beobachten, ob der kritische Winkel nicht gleich α (siehe Abb. 1).

Anwendung von G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten

Astrozyten ausdrückliche einer Vielzahl von Gq-gekoppelte Rezeptoren ^{6, 7,} einschließlich metabotropen Glutamat-Rezeptoren und P2Y-Rezeptoren (Agonist, ATP, ADP). Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu einem signifikanten Anstieg der intrazellulären Calcium-Spiegel innerhalb von Astrozyten. Zum Beispiel kann man leicht beobachten intrazellulären Calcium-Erhöhungen bei der Anwendung von ATP (30 nM) auf Astrozyten ^8-10. Wir verwenden eine schnelle Lösung Switcher von Warner Instruments namens VC-77SP Fast-Step Perfusion System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Mit dieser Methode Lösungen können in weniger als ~ 10 ms angewendet werden.

ABBILDUNG 1. Cartoon und Fotografien der Bildgebung einzurichten. A. zeigt ein Foto des Mikroskops auf einem Lufttisch montiert, während (B) zeigt ein Foto des Laser-Montage, Steuerungen und Strahl-Boxen. C. zeigt ein Foto des Mikroskoptisches mit der Kammer für die Bildgebung montiert. Auf der linken Seite der schnellen Perfusion Gerät gesehen werden kann (zusammen mit dem Schrittmotor-und Theta-Rohre) werden. Auf der rechten Seite der headstage eines Axopatch 200A Verstärker zu sehen ist. Die Karikatur schematisiert den Lichtweg in die Einrichtung und wie TIRF erreicht ist. Der Laser ist auf der hinteren Brennebene des 60X 1,45 NA Objektiv und seine Position fokussiert wird aus der Mitte so eingestellt, dass es in den Immersionsöl tritt am kritischen Winkel α. An diesem Punkt des Strahls leidet Totalreflexion und zerfällt mit einer Distanz λ (siehe Gleichung in Haupttext) in das Medium mit niedrigerem Brechungsindex. In diesem Fall ist dies die Aufzeichnungspuffer um den Astrozyten und den Astrozyten sich. Das Ergebnis ist optische Anregung (und damit imaging) von Molekülen innerhalb von ~ 100 nm der Plasmamembran. In der Karikatur der Zelle das ist so grün "excited" Membran-Rezeptoren gezeigt, während die innerhalb der Zelle oder auf der Oberseite der Zelle nicht angeregt werden. Eine vollständige Darstellung der TIRF-Mikroskopie wurde von Steyer und Almers ⁴ wurde zur Verfügung gestellt.

ABBILDUNG 2. Images von 100 nm fluoreszierende Kügelchen mit EPI und TIRF-Mikroskopie erworben. A. Zeigt EPI Bilder ein Sichtfeld mit mehreren Dutzend 100 nm fluoreszierende Kügelchen. Die roten Pfeile zeigen auf Perlen, die auf das Deckglas niedergelassen haben, während die blauen Pfeilspitzen zu Perlen, die Diffusion in Wasser zeigen. B. Zeigt eine TIRF-Bild der gleichen Sichtfeld wie in A. In dieser Ansicht wird nur angezeigt, die Anhänger Perlen durch rote Pfeile dargestellt sichtbar sind. Dies liegt daran, diese auf das Glas coverlsip niedergelassen hatten und waren somit in der ~ 100 nm Evaneszentfeld. Die Perlen in A durch blaue Pfeile angezeigt werden, nicht innerhalb dieser Region und sind somit unsichtbar im TIRF Bilder. Die unteren Diagramme zeigen 3D-Rendering der Bilder. Es ist klar, dass eine starke Zunahme der Signal-Rausch-für Perlen im Evaneszentfeld tritt auf, wenn durch TIRF-Mikroskopie beobachtet. In der Tat für diese Bilder das Signal-Rausch-für EPI betrug 7,1 ± 0,6, während für TIRF es 20 war ± 0,7.

ABBILDUNG 3. Images von Astrozyten mit Fluo-4 Calcium-Indikator-Farbstoff mit EPI und TIRF-Mikroskopie erworben geladen. A. EPI Bilder ein Sichtfeld mit fünf Astrozyten. B. A TIRF-Bild der gleichen Sichtfeld in B. Beachten Sie, dass die Bilder in A und B signifikant unterschiedlich dargestellt. Dies liegt daran, mit TIRF Beleuchtung nur der Plasmamembran Regionen in enger Apposition an der Deckglas abgebildet werden. Die unteren Bilder zeigen ATP-evozierte intrazellulären Calcium-Transienten mit EPI und TIRF-Mikroskopie abgebildet.

Es ist gut etabliert, dass Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen angezeigt. Diese spontan auftreten, kann durch neuronale Aktivität oder durch die Anwendung von Agonisten an Rezeptoren auf der Oberfläche ¹¹ Astrozyten aktivieren ausgelöst werden. Eine wichtige und umstrittene Frage ist, ob Astrozyten intrazellulären Calcium-Erhebungen können die Freisetzung von Signalmolekülen, die Rezeptoren aktivieren auf Neuronen ^{11, 12} auslösen. Dies ist umstritten, weil es Beweise für und gegen diese Ansicht, wie in den Bewertungen durch die Haydon ^{7, 13} und McCarthy ¹¹ Labors hervorgehoben wurde. Basierend auf unserer letzten Hirnschnitt Bildgebung und Elektrophysiologie Daten, die wir argumentiert, dass eine bessere und genaue Kenntnis der Astrozyten Calcium-Dynamik erforderlich ist, bevor neue Hypothese angetrieben Experimente entwickelt, um festzustellen, wie Astrozyten Auswirkungen Neuronen ¹⁴ sein. In diesem Video-Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, um Bild in der Nähe Plasmamembran und globale intrazellulären Calcium-Änderungen fast gleichzeitig in kultivierten Astrozyten. Eine unvermeidliche technische Anforderung der TIRF-Mikroskopie ist, dass kultivierte Zellen verwendet werden müssen, weil sie sich an einem Deckglas in der Evaneszentfeld Tiefe ^3. Es ist erwähnenswert, dass Astrozyten in Kultur ihrer Genexpressionsprofile ändern, wenn diese in vivo ¹⁵ verglichen, so dass diese Einschränkung sollte bei der Umsetzung dieser Methode werden. Mit dieser Überlegung im Hinterkopf jedoch die einfache Methode, die wir berichten muss man, um Bild zu ermöglichen und zu quantifizieren, in der Nähe Plasmamembran und globale intrazellulären Calcium-Änderungen fast gleichzeitig. Die weitere Anwendung des Ansatzes auf Astrozyten hält das Versprechen, genaue Daten über die intrazellulären Calcium-Änderungen in der Nähe der Plasmamembran von Astrozyten. Die Verfügbarkeit solcher quantitativen Daten nützlich sein wird für die gesamte Verständnis der Astrozyten Biologie.