Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Procédures expérimentales

La procédure expérimentale se compose de deux parties principales qui sont décrits d'une façon par étapes ci-dessous.

Partie 1: PRÉPARATION DES CULTURES hippocampique astrocyte

Brièvement, mélangé hippocampique astrocyte-neurone cultures ont été préparés en utilisant un protocole bien établi ^1,2,3. Nous avons optimisé la procédure de céder saine astrocytes mis en culture. Toutes les procédures énumérées ci-dessous doit être effectuée dans un environnement stérile, comme une hotte à flux laminaire.

Préparation des lamelles

• 22 lamelles mm (VWR, 48380-068)
• Poly-D-Lysine (PDL, Sigma P0899), des aliquotes (1 mg / ml)
• La laminine aliquotes (20 pg / ml): ajouter 49 ml d'eau stérile à 1 mg / ml solution laminine (Sigma L2020), faire 1,2 aliquotes ml et conserver à -20 ° C

1. Dissoudre PDL dans l'eau stérile (50 pg / ml)
2. Autoclaver les lamelles, rincez à l'eau stérile et le placer dans PDL (20 ml pour 100 lamelles). Laisser à température ambiante jusqu'au lendemain.
3. Remplacer PDL à l'eau stérile (3 lavages extensifs). Puis sécher les lamelles et conserver à 4 ° C.
4. Le jour avant l'étalement des lamelles les astrocytes place individuelle dans un puits stérile sur une plaque à 6 puits (Multiwell fond plat Plaques avec couvercles, stériles de BD Bioscience). Mettez 400 pi de la laminine sur chaque lamelle et incuber pendant la nuit, dans l'incubateur pour éviter l'évaporation.

Dissection

Dissection des médias:

• 500 ml de Earle solution saline équilibrée (EBSS) (1X), liquide (Invitrogen, 14155-063)
• 5 ml solution HEPES (Sigma, H0887)

Les médias hippocampe:

• 412,5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) (1X), liquide contient des sels de Earle, mais pas de rouge de L-glutamine ou du phénol (Invitrogen, 51200-038)
• 10 ml de glucose (Sigma, D-(+)-glucose anhydre SIGMA ULTRA G7528) 1 M dans du MEM
• 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122)
• 5 ml de solution de pyruvate de sodium (Sigma, S8636)
• 12,5 ml d'HEPES solution 1 M (Sigma, H0887)
• 5 ml de N-2 Supplément (100X), liquide (Invitrogen, 17502-048)
• 50 ml de sérum de cheval, inactivé par la chaleur (Invitrogen, 26050-088)

Solution de papaïne:

• Ajouter 5 ml de milieu de dissection dans Worthington PAPAÏNE-022 flacon (LK003178; concentration finale de 20 U / ml) et incuber à 37 ° C pendant 60 min.

1. Décapitez ratons âgés de P1 (généralement 2 chiots) suivant les lignes directrices révisées et approuvées par les réglementations nationales et de vos soins locaux des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.
2. Enlever la peau et le crâne et le cerveau dans une boîte de Pétri remplie avec les médias de dissection froide.
3. Suppression des méninges, disséquer les deux hémisphères et disséquer hippocampes.
4. Hacher les hippocampes dans ~ 1X1 pièces mm et digérer en solution papaïne à 37 ° C pendant min 11-13.
5. Une fois les morceaux de tissu sont installés, retirez soigneusement la papaïne et ajouter 5 ml de milieu de l'hippocampe pour éliminer toute trace de l'enzyme. Répétez cette étape et remettre dans le milieu de l'hippocampe (2 ml).
6. Triturer les cellules ~ 5 fois jusqu'à ce qu'il n'y touffes gauche, avec trois flammes poli pipettes de trous progressivement plus petits (1000 um, ~ ~ 500 um et 300 um).
7. Une fois trituré, passer les cellules à travers une passoire de cellules (taille des pores, 70 um, BD Biosciences). Compter les cellules dans 10 pl de suspension. Réglez le volume du milieu de l'hippocampe dans le but d'avoir 400 000 cellules / ml.
8. Aspirer le laminine hors les lamelles, et avant le couvre peut sécher, la plaque 200 pl de la suspension cellulaire par lamelle.
9. Laissez-les à joindre pendant 60 min dans l'incubateur, puis ajouter 2 ml de milieu de l'hippocampe par puits.
10. Le lendemain, aspirer ancienne moyennes hippocampe pour enlever les cellules mortes et les débris et ajouter 2 ml de pré-chauffé moyennes hippocampique frais.

Entretien

Les médias Neurobasal:

• 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
• 10 ml de sérum B27 supplément gratuit (Invitrogen, 17504-044)
• 5 ml de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, 15140-122)
• 1,25 ml de L-glutamine (Invitrogen, 25030-149)

Nourrissez les cultures astrocytes neurone deux fois par semaine avec milieu neurobasal, à commencer quatre jours après placage. Préincuber les médias à environ 30 minutes dans l'incubateur dans un flacon aéré pour équilibrer la température et le CO _2.

Partie 2: imagerie calcique

Mémoire tampon d'enregistrement hippocampe: 110 mM NaCl, 5,4 mMKCl, 1,8 _mM de CaCl2, 0,8 mM _MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (Tous les produits chimiques de Sigma) pH 7,4 (ajusté avec NaOH).

Chargement colorant indicateur de calcium dans les astrocytes

1. Placer la culture dans un puits sur une plaque à 6 puits remplis avec 2 ml de tampon d'enregistrement hippocampe contenant 2,5 uM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) et 0,05% Pluronic ® solution F-127 de 20% dans le DMSO (Invitrogen, P-3000MP) et incuber à température ambiante pendant 10-30 min.
2. Retirer Fluo-4 solution et laver lamelles 3 fois avec un tampon d'enregistrement de l'hippocampe et incuber à température ambiante pendant 30 min.
3. Placer la lamelle sur la chambre, propre et de l'autre côté de la lamelle avec un liquide de nettoyage pour lentilles.
4. Mettez une petite goutte d'huile d'immersion (DF type à immersion d'huile à partir Cargille) sur l'objectif et de mettre la chambre (chambre ouverte pour 25 mm rond lamelle de Warner Instruments) sur la platine du microscope (Olympus IX71).
5. Regardez les cellules en utilisant la lumière de transmission de voir comment les cellules regard, et les amener au point. Puis éclairent les cellules avec 488 nm à partir d'un monochromateur (V polychrome de Till Vision) et de déterminer si le signal de fluorescence du fluo-4 est uniforme et détectable dans les astrocytes.
6. Utilisez le PEV et l'éclairage TIRF pour mesurer le calcium dans les astrocytes.

Microscopie TIRF

En bref, nous utilisons un microscope Olympus IX71 équipé d'une caméra Andor IXON DV887DCS EMCCD. Le contrôle de l'excitation et l'acquisition des images est réalisé en utilisant le logiciel TILLVision. Les poutres de 454/488/515 nm Argon (100 mW) et 442 nm état solide (45 MW) lasers sont combinés et contrôlée avec un laser TILL Polyligne combineur, condenseur à double port et de la FRBR acoustoptical filtre accordable et le contrôleur (AOTF; tous de TILL Photonics) et nourris dans une fibre à large bande pour l'entrée en Kineflex le condenseur FRBR. Nous utilisons un Olympus 60X 1,45 NA pour atteindre l'objectif FRBR. Le gain de la caméra est ajusté pour chaque astrocyte pour fournir le meilleur rapport signal sur bruit des images. Le contexte et les principes de microscopie TIRF ont été récemment revu ^{4, 5.} La plupart des composants optiques que nous utilisons ont été achetés auprès TILL Photonics, qui fait maintenant partie de Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). La profondeur de pénétration TIR peut être calculé à partir des équations ci-dessous.

d = profondeur de pénétration

Indice de réfraction n1 = de verre

n2 = indice de réfraction de la cellule

a = angle d'incidence

NAi = ouverture numérique de l'incidence

Afin d'assurer le laser est aligné de façon optimale pour la FRBR, nous trouvons qu'il est utile d'observer 100 nm bille fluorescente (Invitrogen, F8803). Nous présentons des images fixes et des vidéos de perles avec le PEV et la microscopie TIRF. Lorsque dans les FRBR, on observe une augmentation spectaculaire de signal-bruit et les perles d'affichage diffusion brownienne. Nous estimons qu'il est utile d'observer le comportement de 100 nm avec des perles microscopie TIRF sur une base régulière (~ une fois par semaine) pour être sûr que la FRBR optimale se produit, plutôt que de l'éclairage oblique, compromis qui se produirait si l'angle critique ne sont pas égaux à α (voir fig 1).

Application de la protéine G agonistes des récepteurs couplés

Les astrocytes expriment une variété de GQ récepteurs couplés aux ^{6, 7,} y compris les récepteurs de glutamate métabotropique et des récepteurs P2Y (agoniste, ATP, ADP). L'activation de ces récepteurs conduit à une augmentation significative du taux de calcium intracellulaire dans les astrocytes. Par exemple, on peut facilement observer des élévations de calcium intracellulaire pendant l'application de l'ATP (30 uM) à ^8-10 astrocytes. Nous utilisons une solution rapide de commutation de Warner Instruments appelé le Système VC-77SP perfusion rapide Étape (http://www.warneronline.com/index.cfm). Avec cette méthode peut être des solutions appliquées en moins de ~ 10 ms.

Cartoon FIGURE 1. Et des photographies de l'imagerie mis en place. A. montre une photographie du microscope monté sur une airtable, alors que (B) montre une photographie de l'assemblage laser, les contrôleurs et les boîtes de faisceau. C montre une photo de la platine du microscope à la chambre de montée pour l'imagerie. Sur la gauche du dispositif de perfusion rapide peut être vu (avec le moteur pas à pas et tubes thêta). Sur la droite du headstage d'un amplificateur Axopatch 200A est vu. La caricature schématise le trajet de la lumière dans la mise en place et comment TFRI est atteint. Le laser est focalisé sur le plan focal arrière de l'objectif 60X 1,45 NA et sa position est ajustée décentré afin qu'elle émerge dans l'huile d'immersion à l'angle critique α. A ce point le faisceau souffre d'une réflexion interne totale et se désintègre avec une λ distance (voir l'équation dans le texte principal) dans le milieu de l'indice de réfraction plus faible. Dans ce cas, il s'agit de la mémoire tampon d'enregistrement entourant les astrocytes et les astrocytes eux-mêmes. Le résultat est une excitation optique (et donc d'imagerie) des molécules dans ~ 100 nm de la membrane plasmique. Dans le dessin animé de la cellule de ceci est montré que le vert "excité" récepteurs membranaires, alors que ceux au sein de la cellule ou sur la surface supérieure de la cellule ne sont pas excités. Un compte rendu complet de la microscopie TIRF a été fournie par Steyer et Almers ^4.

FIGURE 2. Images de 100 perles fluorescentes nm acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. montre des images du PEV d'un champ de vue avec des perles de plusieurs dizaines de nm 100 fluorescentes. Le point rouge flèches aux perles qui se sont installés sur la lamelle de verre, tandis que les flèches bleues au point de perles qui se diffusent dans l'eau. B. montre une image TIRF du même champ de vision, comme indiqué en A. Dans ce point de vue que les perles adhérente représentée par les flèches rouges sont visibles. C'est parce que ces s'étaient installés sur le verre et coverlsip étaient donc dans le domaine de ~ 100 nm évanescente. Les perles montré dans une des flèches bleues ne sont pas dans cette région et sont donc invisibles dans les images FRBR. Les parcelles inférieures montrent un rendu 3D des images. Il est clair qu'une augmentation importante de signal-bruit est produit pour les billes dans le champ évanescent lorsque observées par microscopie TIRF. En fait, pour ces images le signal-bruit pour le PEV a été de 7,1 ± 0,6, tandis que pour la FRBR il était de 20 ± 0,7.

FIGURE 3. Images des astrocytes chargées avec Fluo-4 colorant indicateur de calcium acquis avec le PEV et la microscopie TIRF. A. PEV images d'un champ de vue avec cinq astrocytes. B. Une image TIRF du même champ de vue montré dans la note B. que les images de A et B sont sensiblement différentes. C'est parce qu'avec la FRBR seul éclairage de la membrane plasmique des régions en apposition à proximité de la lamelle de verre sont imagés. Les panneaux inférieurs montrent ATP évoqué transitoires du calcium intracellulaire imagées avec le PEV et la microscopie TIRF.

Il est bien établi que les astrocytes affichage des élévations de calcium intracellulaire. Ils se produisent spontanément, peut être déclenchée par l'activité neuronale ou par application d'agonistes à activer les récepteurs à la surface des astrocytes ^11. Une question importante et controversée est de savoir si astrocytes élévations de calcium intracellulaire peut déclencher la libération de molécules de signalisation qui activent les récepteurs des neurones ^{11, 12.} Ceci est controversée, car il ya eu des preuves pour et contre ce point de vue, comme l'a souligné dans les commentaires par le Haydon ^{7, 13} et ¹¹ laboratoires de McCarthy. Basé sur notre tranche de l'imagerie cérébrale et des données récentes en électrophysiologie, nous a fait valoir qu'une meilleure compréhension de la dynamique et précis de calcium astrocytaire est nécessaire avant des expériences nouvelles hypothèses de conduite peuvent être conçus afin de déterminer comment les neurones astrocytes d'impact ^14. Dans cet article, la vidéo, nous présentons une méthode simple à l'image près membrane plasmique et mondiales des changements de calcium intracellulaire presque simultanément dans les astrocytes en culture. Une exigence incontournable technique de microscopie TIRF est que les cellules cultivées doivent être utilisés parce qu'ils adhèrent à une lamelle de verre au sein de la profondeur de champ évanescent ^3. Il est à noter que les astrocytes en culture modifier leurs profils d'expression génique par rapport à ceux in vivo ^15, et ainsi cette mise en garde doivent être considérés lors de l'application de cette méthode. Avec cette considération à l'esprit cependant la méthode simple nous rapportons ne permettent de quantifier la proximité de l'image et la membrane plasmique et mondiales des changements de calcium intracellulaire presque simultanément. La nouvelle application de l'approche de la astrocytes tient la promesse de fournir des données précises sur les changements de calcium intracellulaire près de la membrane plasmique des astrocytes. La disponibilité de telles données quantitatives seront utiles pour la compréhension complète de la biologie des astrocytes.