Mätning nära plasmamembran och Global Intracellulär Dynamics Kalcium i Astrocyter

Experimentella

Den experimentella förfarande består av två viktiga delar som beskrivs i ett steg klokt sätt nedan.

Del 1: Förbereda hippocampus astrocyternas KULTURER

Kortfattat var blandade hippocampus astrocyternas-neuron kulturer prepareras med ett väletablerat protokoll ^1,2,3. Vi optimerat proceduren att ge friska odlade astrocyter. Alla förfaranden som anges nedan bör ske i en steril miljö som ett laminärt flöde huva.

Förbereda täckglas

• 22 mm täckglas (VWR, 48.380-068)
• Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P0899), alikvoter (1 mg / ml)
• Laminin alikvoter (20 mikrogram / ml): Lägg till 49 ml sterilt vatten till 1 mg / ml laminin lösning (Sigma L2020), gör 1,2 ml alikvoter och förvara vid -20 ° C

1. Lös PDL i sterilt vatten (50 mikrogram / ml)
2. Autoklav den täckglas, skölj med sterilt vatten och placera i PDL (20 ml för 100 täckglas). Låt stå i rumstemperatur över natten.
3. Byt PDL med sterilt vatten (3 omfattande tvättar). Torka sedan täckglas och förvara vid 4 ° C.
4. Dagen innan plätering av astrocyter, placera enskilda täckglas i ett sterilt väl på en 6-brunnar (multispot flat botten plattor med lock, steril från BD Bioscience). Sätt 400 ìl av laminin på varje täckglas och inkubera över natten, i inkubatorn för att undvika avdunstning.

Dissection

Dissection media:

• 500 ml Earles Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), flytande (Invitrogen, 14.155-063)
• 5 ml HEPES lösning (Sigma, H0887)

Hippocampus media:

• 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), innehÃ¥ller flytande Earles salter, men ingen L-glutamin eller fenol rött (Invitrogen, 51.200-038)
• 10 ml glukos (Sigma, D-(+)-glukos vattenfri SIGMA ULTRA G7528) 1 M i MEM
• 5 ml Penicillin-streptomycin (Invitrogen, 15.140-122)
• 5 ml natrium pyruvat lösning (Sigma, S8636)
• 12,5 ml HEPES lösning 1 Mkr (Sigma, H0887)
• 5 ml N-2 Tillägg (100X), flytande (Invitrogen, 17.502-048)
• 50 ml hästserum, värmeinaktiveras (Invitrogen, 26.050-088)

Papain lösning:

• Tillsätt 5 ml dissektion medier i Worthington papain-022 flaska (LK003178, slutlig koncentration, 20 U / ml) och inkubera vid 37 ° C i 60 min.

1. Halshugga råttungar åldrarna P1 (typiskt 2 valpar) följande riktlinjer granskats och godkänts av nationella regler och lokala institutionella Djurvård och användning kommittén.
2. Ta bort skinn och skalle och placera hjärna i petriskål fylld med kallt dissektion medier.
3. Borttagen hjärnhinnor, dissekera båda halvkloten och dissekera hippocampi.
4. Hacka hippocampi till ~ 1X1 mm bitar och smälta i papain lösning vid 37 ° C i 11-13 min.
5. När bitar av vävnad har bosatt sig, ta bort papain försiktigt och tillsätt 5 ml hippocampus medel att avlägsna alla spår av enzymet. Upprepa detta steg och återsuspendera i hippocampus medelstora (2 ml).
6. Mal sönder cellerna ~ 5 gånger tills det inte finns några kvar klumpar, med tre lågor-polerad pipetter successivt mindre hål (1000 ìm, ~ 500 ìm och ~ 300 mikrometer).
7. När grov-, passera celler genom en cell sil (porstorlek, 70 ìm, BD Bioscience). Räkna celler i 10 ìl suspension. Justera volymen på hippocampus medium för att ha 400.000 celler / ml.
8. Aspirera laminin bort täckglas, och innan skydden kan torka, platta 200 l av cellsuspensionen per täckglas.
9. Lämna dem att fästa i 60 min i inkubatorn, och tillsätt sedan 2 ml hippocampus medelstora per brunn.
10. Nästa dag, aspirera gamla hippocampus medel för att avlägsna döda celler och smuts och tillsätt 2 ml av förvärmda frisk hippocampus medium.

Underhåll

Neurobasal media:

• 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12.348-017)
• 10 ml B27 i serum gratis tillägg (Invitrogen, 17.504-044)
• 5 ml Penicillin-streptomycin (Invitrogen, 15.140-122)
• 1,25 ml L-glutamin (Invitrogen, 25.030-149)

Mata astrocyternas-neuron kulturerna två gånger i veckan med neurobasal medium, börjar fyra dagar efter plätering. Preincubate media ca 30 min i inkubatorn i ett ventilerat kolven till jämvikt temperatur och CO _2.

Del 2: Kalcium IMAGING

Hippocampus inspelning buffert: 110 mM NaCl, 5,4 mmKCl, 1,8 mM CaCl _2, 0,8 mM MgCl _2, 10 mm D-glukos, 10 mm HEPES (Alla kemikalier från Sigma) pH 7,4 (justeras med NaOH).

Laddningsfärg kalcium indikator i astrocyter

1. Placera kultur i en brunn på en 6-brunnar fyllda med 2 ml hippocampus inspelning buffert som innehåller 2,5 mikroM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14.217) och 0,05% Pluronic ® F-127 20% lösning i DMSO (Invitrogen, P-3000MP) och inkubera i rumstemperatur i 10-30 min.
2. Ta bort Fluo-4-lösning och tvätta täckglas 3 gånger med hippocampus inspelning buffert och inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
3. Placera täckglas på kammaren, och rengör den andra sidan av täckglas med lins rengöringsmedel.
4. Sätt en liten droppe immersionsolja (immersionsolja type df från Cargille) om målet och sätta kammare (öppen kammare för 25 mm runda täckglaset från Warner Instruments) på scenen i mikroskop (Olympus IX71).
5. Titta på cellerna med hjälp av överföring ljus för att se hur cellerna ser ut, och få dem i fokus. Då lyser upp cellerna med 488 nm från en monokromator (polykrom V från TILL Vision) och avgöra om fluorescens signal Fluo-4 är enhetlig och detekteras i astrocyter.
6. Använd EPI och TIRF belysning för att mäta kalcium i astrocyter.

TIRF mikroskopi

Kortfattat använder vi en Olympus IX71 mikroskop utrustat med en Andor IXON DV887DCS EMCCD kamera. Kontrollen av excitation och bild Förvärvet sker med hjälp av TILLVision programvara. Bjälkarna i 454/488/515 nm Argon (100 mW) och 442 nm solid state (45 mW) lasrar kombineras och kontrolleras med A till Polyline laser combiner, TIRF dubbla portar kondensor och acoustoptical avstämbar filter och regulator (AOTF, alla från TILL Fotonik) och matas in i en Kineflex brett band fiber för inträde i TIRF kondensorn. Vi använder en Olympus 60X 1,45 NA-lins för att uppnå TIRF. Kameran får justeras för varje astrocyternas att ge bästa signal-brus-bilder. Bakgrunden och principerna för TIRF mikroskopi har nyligen omdömet ^{4, 5.} De flesta av optiska komponenter vi använder köptes från TILL Photonics, som nu är en del av Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). TIR inträngningsdjup kan beräknas ur ekvationerna nedan.

d = penetrationsdjup

n1 = brytningsindex för glas

n2 = brytningsindex i cell

a = infallsvinkel

NAi = numerisk apertur på förekomst

För att säkerställa att lasern är anpassad optimalt för TIRF vi finner det användbart att observera 100 nm fluorescerande pärla (Invitrogen, F8803). Vi presenterar stillbilder och video av pärlor med EPI och TIRF mikroskopi. När i TIRF, konstaterar en en dramatisk ökning av signal-brus och kulorna visa Brownsk diffusion. Vi finner det användbart att observera beteendet hos 100 nm pärlor med TIRF mikroskopi på en regelbunden basis (~ en gång i veckan) för att vara säker på att optimala TIRF uppstår, snarare än äventyras sned belysning som skulle uppstå om den kritiska vinkeln var inte lika med α (se figur 1).

Tillämpning av G-protein-agonister receptor

Astrocyter uttrycker en variation av GQ-kopplade receptorer ^{6, 7} inklusive metabotropa glutamatreceptorer och P2Y receptorer (agonist, ATP, ADP). Aktivering av dessa receptorer leder till betydande ökningar av intracellulär kalcium nivåer inom astrocyter. Till exempel kan man observera lätt intracellulär kalcium förhöjningar vid tillämpningen av ATP (30 M) till astrocyter ^8-10. Vi använder en snabb lösning switcher från Warner instrument som kallas VC-77SP Snabb-Steg Perfusion System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Med denna metod lösningar kan tillämpas på mindre än ~ 10 ms.

FIGUR 1. Tecknad film och fotografier av avbildning inrättas. A. Visar ett foto av mikroskop monterad på en airtable, medan (B) visar ett fotografi av laser montering, controllers och lådor balk. C. Visar ett fotografi av mikroskop scenen med kammaren monterad för avbildning. Till vänster den snabba perfusionen enheten kan ses (tillsammans med stegmotor och theta slangar). Till höger headstage av en Axopatch 200A förstärkare sett. Den tecknade schematizes ljusstrålen i inrättandet och hur TIRF har uppnåtts. Lasern är fokuserad på baksidan fokalplan 60X 1,45 NA objektiv och dess läge justeras av centrum så att det framgår i immersionsolja vid den kritiska vinkeln α. Vid denna punkt strålen lider av total inre reflektion och sönderfaller med ett avstånd λ (se ekvation i huvudtexten) på medellång med lägre brytningsindex. I detta fall är inspelningen buffert som omger astrocyter och astrocyter själva. Resultatet är optisk excitation (och därmed imaging) av molekyler inom ~ 100 nm i plasmamembranet. I den tecknade av cellen detta visas som grön "excited" membran receptorer, medan de inom cellen eller på ovansidan av cellen är inte glada. En fullständig redovisning av TIRF mikroskopi har tillhandahållits av Steyer och Almers ^4.

FIGUR 2. Bilder på 100 nm fluorescerande pärlor förvärvades med EPI och TIRF mikroskopi. A. Visar EPI bilder av ett synfält med flera dussin 100 nm fluorescerande pärlor. De röda pilarna pekar på pärlor som bosatte sig på glaset täckglaset, medan de blå pilarna pekar på pärlor som är diffuserande i vatten. B. Visar en TIRF bild i samma synfält som visas i A. I den här vyn bara tillhörande pärlor visas med röda pilar är synliga. Detta beror på att dessa hade slagit sig på glaset coverlsip och var därmed i ~ 100 nm försvinnande området. Kulorna visas i ett av blå pilar inte är inom denna region och är därför osynliga i TIRF bilderna. Den lägre tomterna visa 3D-rendering av bilderna. Det är klart att en stor ökning av signal-brus uppstår för pärlor inom försvinnande fältet när observerats av TIRF mikroskopi. Faktum är att för dessa bilder signal-brus för EPI 7,1 ± 0,6, medan det för TIRF det var 20 ± 0,7.

FIGUR 3. Bilder av astrocyter laddade med Fluo-4 kalcium indikator färga förvärvades med EPI och TIRF mikroskopi. A. EPI bilder av ett synfält med fem astrocyter. B. En TIRF bild i samma synfält som visas i B. Observera att bilderna i A och B är mycket olika. Detta beror med TIRF belysning bara plasmamembranet regioner i nära apposition mot glaset täckglaset är avbildade. Den nedre panelerna visar ATP-framkallat intracellulär kalcium transienter avbildade med EPI och TIRF mikroskopi.

Det är väl etablerat att astrocyter visa intracellulär kalcium höjder. Dessa uppträda spontant, kan utlösas av nervaktivitet eller genom tillämpning av agonister för att aktivera receptorer pÃ¥ astrocyternas ytan ^11. En viktig och kontroversiell frÃ¥ga är om astrocyternas intracellulär kalcium förhöjningar kan utlösa frisättning av signalmolekyler som aktiverar receptorer pÃ¥ nervceller ^{11, 12.} Detta är kontroversiellt eftersom det har belägg för och emot denna uppfattning, vilket betonas i de översyner av Haydon ^{7, 13} och McCarthy ¹¹ laboratorier. Baserat pÃ¥ vÃ¥ra senaste hjärnan skiva bildbehandling och elektrofysiologi data vi hävdade att en bättre och tydlig uppfattning av astrocyternas kalcium dynamik behövs innan ny hypotes drivna experiment kan utformas för att bestämma hur astrocyter pÃ¥verkar nervceller ^14. I denna video artikeln presenterar vi en enkel metod för att bilden nära plasmamembranet och globala intracellulära förändringar kalcium nästan samtidigt i odlade astrocyter. En oundviklig tekniskt krav för TIRF mikroskopi är att odlade celler mÃ¥ste användas eftersom de följer ett glas täckglas inom försvinnande fältet djup ^3. Det är värt att notera att astrocyter i kulturen ändra sina profiler genuttryck jämfört med dem som in ^vivo-15, och sÃ¥ denna varning bör beaktas vid genomförandet av denna metod. Med detta övervägande i Ã¥tanke dock den enkla metoden rapporterar vi tillÃ¥ter en till bild och kvantifiera nära plasmamembran och globala intracellulära förändringar kalcium nästan samtidigt. Den fortsatta tillämpningen av den inställning till astrocyter hÃ¥ller löftet om att ge korrekta uppgifter om intracellulär kalcium förändringar nära membranet pÃ¥ astrocyter. TillgÃ¥ngen pÃ¥ sÃ¥dana kvantitativa data kommer att vara användbar för fullständig förstÃ¥else av astrocyternas biologi.