Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

בנייה של זנים דיפלואידי
פרוטוקול לייצור diploids ידי הזדווגות

1. זנים הראשוני צריך להיות הכה על YPD בינוני, או סלקטיבי במידת הצורך, כדי לייצר מושבות אחת. שני זנים הפלואידים צריך להיות סוג של הזדווגות ההפוך (כלומר, מאטה ו MATα).
2. באמצעות לולאה חיסון סטרילי לקחת חלק קטן במושבה מאחד שני זנים הפלואידים. על צלחת פס חדש YPD את הלולאה פעם אחת בקו ישר על פני הצלחת. סמן את כיוון פס עם חץ בתחתית הצלחת.
3. חזור על פעולה זו עבור זן השני בצלחת YPD אותו. הפעם פס בניצב אל המושבה הראשונה, חציית פס הראשון עם השני. סמן את כיוון פס השני וציין את האזור שבו פס second חוצה את הראשון. אזור זה יהיה שם diploids יופק.
4. דגירה את הצלחת YPD ב 30 ° C במשך הלילה.
5. Replica צלחת צלחת YPD על גבי מדיה סלקטיבית כי יהיה סלקטיבי היתר גידול שזה עתה קמו diploids.
6. פיק מושבה אחת אם אפשר, או חלק קטן של פס דיפלואידי ו פס על המדיום סלקטיבית אותו כדי ליצור מושבות אחת.

נביגה ועיכול asci
פרוטוקול

1. פיק מושבות אחת מהצלחת לעיל ולעשות קטן (1cm x 1cm) כתמים על נביגה (SPO) צלחות לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 3-7 ימים sporulate.
2. נביגה ניתן לבדוק על ידי הסתכלות על התאים מפני תיקון כל במיקרוסקופ אור. תאים מקום בשקופית מיקרוסקופ μl 5-10 של מים, במקום coverslip על גבי אגל, ולחפש בנוכחות asci. אם asci לא נמצאים בקלות ואז להחזיר בחממה.
3. אם יש נביגה יעיל אחד התיקונים, להכין צינור סטרילי חרוטי עם 15 מ"ל של מיץ 100μL הטטרדה.
4. פיק תאים למעלה מ תיקון זה נביגה עם לולאה חיסון סטרילי 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומניחים מיץ הטטרדה. מערבולת בעדינות את הלולאה על מנת לאפשר לתאים ליפול הלולאה ומערבבים עם הפתרון.
5. השאירו במיץ הטטרדה (המכיל zymolyase) עבור 4-10mins (תלוי בריכוז ופעילות של zymolyase והמתח עצמה). זה מאפשר עיכול של התא הקיר המקיף את ascospores.
6. סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD.
7. אופציונלי. תגובת ניתן לעצור על ידי הוספת 1mL של קרים כקרח סטרילי DH ₂ O. אפשר התאים להסתפק 5mins. הסר 1mL מ supernatant ואז לערבב קלות ביד ולשמור על הקרח.
8. קח 5μL של תאים מתעכל משלב 5 ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD.
9. השתמש לולאה סטרילי חיסון 3mm להפיץ מאוד בעדינות את טיפות 1-3 פעמים בקו בעוד בקושי ביצירת קשר עם אגר.
10. אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר (אם צעד 7 מושמט, זה כאשר מערכת העיכול של התא הקיר החיצוני יהיה מופחת או להפסיק). המשך המיקרוסקופ לנתיחה.

Dissection של Asci
פרוטוקול

ראוי לציין, כי פרוטוקול הבאים מתוארת עבור מיקרוסקופ זינגר MSM מערכת המיקרומניפולציה 200. פרוטוקול זה יכול להיות מלווה בשינויים קלים אם באמצעות micromanipulator ידני כגון micromanipulator MR Zeiss.

1. התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד.
2. עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום.
3. מעבר למצב החיפוש. איתור asci. רצוי לבחור asci אשר נמצאים באזורים בהם התאים מפוזרים היטב. הימנע שטחים עם אשכולות התא. ארבעת ascospores מ asci עדיין צריך להיות קשור אחד לשני. שני ascospores עשוי להיות מעט גדול יותר משני האחרים. הימנע לקטוף asci שבו ascospore רופף ולא מחובר לשאר ascospores.
4. תרימי נאד עם המחט. לאט לאט מביאים את המחט את הצלחת. כאשר צל של microneedle הוא ראה, בשורה הזאת עם נאד כדי להיות נטל. שוב הגישה את המחט עד קו המתאר השחור של מעגל (קצה המחט) נתפסת. מגע הטטרדה עם המעגל הזה ולאחר מכן במהירות למשוך את המחט משם. ודא כל ארבעת ascospores מתוך נאד דבקו המחט וכי אין תאים נוספים נאספו על microneedle כי אינם חלק נאד זה.
5. משוך את microneedle הרחק מן הצלחת וללכת המטריצה ​​(עבור נאד הראשונה, ללכתעמדת A1). שימו לב למיקום שבו כל נאד היא עברה. מניחים את נאד על ידי נגיעה צלחת עם microneedle ו מתרחק עד כל ארבעת ascospores ירדה microneedle. לחיצה עדינה של הזרוע מחט או את הפלטפורמה מחזיק את צלחת YPD הוא לעתים קרובות שימושי בשלב זה.
6. חזור על שלבים 3-5 ומקום asci לעבר עמדות ברציפות על המטריצה ​​עד המספר הרצוי של asci כבר הרים.
7. חזור אל נאד כל לשבור את ארבעה תאים לגזרים על ידי מתגרה עם המחט, הקשה על פלטפורמה בעדינות או שילוב של שניהם. תרים את התאים לעזוב אחד מאחורי במיקום חדש המטריצה ​​עד שכל ascospore ב נאד כל מופרד בשורות של ארבעה.
8. מניחים את צלחת YPD באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים כדי לבחון את דפוס הצמיחה.
9. Replica צלחת התאים גזור עד בינוני סלקטיבי במידת הצורך.

רילוקיישן של Zygotes
פרוטוקול

1. Streak את שני זנים הפלואידים עם סוגים הזיווג ההפוך על המדיום המתאים כדי להשיג מושבות אחת.
2. אלה Mate שני זנים כמתואר לעיל ולאפשר לגדול מ 4 עד 6 שעות (או לילה במקרה הצורך).
3. בדוק zygotes תחת מיקרוסקופ אור. Zygotes יופיעו המשקולת בצורת תאים עם או בלי ניצן.
4. פיק תאים עם לולאה חיסון 3mm (תאים אמור לכסות ¼ של הלולאה) ומקום בעדינות 100μL של סטרילית DH ₂ O.
5. סמן את החלק העליון והתחתון של האזור inoculum על צלחת YPD.
6. קח 5μL ומניחים בעדינות טיפות בקו באזור inoculum צלחת מראש סימנה את YPD.
7. השתמש לולאה חיסון 3mm להפיץ את טיפות בקו בעדינות רבה תוך בקושי ביצירת קשר עם אגר.
8. אפשר לספוג את הנוזל לתוך אגר. המשך המיקרוסקופ לנתיחה.
9. התמקד באזור של צלחת שבה מחצית השדה מכיל תאים חצי ריקה. לאט לאט מביאים את המחט להתמקד כזאת שזה נוגע באזור ריק השדה. זה יבטיח כי המחט אינו מכיל תאים משימוש קודם. קשר בין מחט לבין אגר נחשבת עיגול שחור כהה לאט מתחדד.
10. עבור המטריצה ​​ב A1 עמדה ולעשות סימן על ידי פירסינג אגר שוב. זו נועדה לסייע לקבוע את הכיוון של הצלחת אם הוא הוריד את המיקרוסקופ לפני סיום.
11. מעבר למצב החיפוש. אתר זיגוטה.
12. תרימי זיגוטה עם המחט.
13. המקום zygotes בנפרד על המטריצה.
14. אפשר zygotes לגדול במשך כמה ימים.
15. צלחת Replica zygotes על המדיום סלקטיבית המתאימה.

נציג תוצאות

איור 1: זיווג של שני זנים הפלואידים סוגי ההזדווגות מול יוצרת זן דיפלואידי.

איור 2: (א) צלחת YPD עם תוצאות thre של הזיווג בין זן טמפרטורה רגיש (עם auxotrophy leu2 א) ו זן סוג בר (LEU2). תאים מתעכל פרושים באזור inoculum בצד שמאל איפה צמיחה עבה בין שני קווים שחורים נתפסת. Asci כי כבר גזור לגדול מחולקת באופן שווה במטריצה ​​בצד ימין. (ב) צלחת ב (א) היה משוכפל לצלחת הנשירה SD-לאוצין. הערה הצמיחה 02:02 עבור הסמן LEU2 המעידים על ascospore תוקף היה גזור. (ג) צלחת ב (א) היה משוכפל על צלחת YPD וטופחו על 37 ° C. שים לב כי הצמיחה 2:02 נוסף מאמת כי ascospore היה גזור.

דיסקציה שמרים הוא כלי שימושי כדי לבחור זנים חדשים עם סמנים הרצוי. בעת קביעת דפוס הצמיחה התיאורטי של ארבעה ascospores חשוב להסתכל גנוטיפ של התא הווגטטיבי. אם הפלסמיד הוא ההווה, צריך לדעת אם הוא עותק יחיד, נמוך או גבוה כמו זה ישפיע אשר ascospore (ים) לקבל את הפלסמיד ואת ישפיע התחזיות והמסקנות לגבי זנים להיות מניפולציות.

זנים מסוימים יכולים sporulate טוב יותר מאחרים לייצר ascospores רבים בתקופה קצרה של זמן. זנים אחרים עשויים להניב רק אחוז נמוך של ascospores. זה אין שום השפעה על הניסוי עוד מספיק asci נכון ניתן לבחור. יתרה מכך, זנים מגיבים באופן שונה במהלך העיכול קיר התא יש צורך להתאים את אמפירית זמן הדגירה במיץ הטטרדה.

בעת בחירת תאים עם סמנים הרצוי, יש לבחור רק אלה שמגיעים asci שבו דפוס הצמיחה של כל ascospores מתאימות דפוס הצמיחה תיאורטיים מן דיסקציה שבו הרוב המכריע של ascospores כל דפוס להוביל את הצמיחה הצפויה.