The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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English Version | Other Languages
1Department of Pathology, University of Washington, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Washington
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Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media. J. Vis. Exp. (27), e1152, doi:10.3791/1152 (2009).
भाग 1: तैयार करें निमेटोड विकास मीडिया प्लेटें (एन जी एम)
इस अनुभाग में जीवन काल प्रयोग में उपयोग के लिए ठोस एन जी एम प्लेटों की तैयारी का वर्णन है. मानक एन जी एम प्लेटें, जो नहीं additives, और Amp / FUDR प्लेटें, जो दोनों एम्पीसिलीन (एएमपी) और (FUDR) fluorodeoxyuridine एन जी एम के लिए जोड़ा है होते हैं: एक बुनियादी जीवन काल प्रयोग प्लेटों के दो प्रकार की आवश्यकता है. एम्पीसिलीन विदेशी बैक्टीरियल संदूषण रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है. FUDR कोशिका विभाजन को रोकता है, अंडा उत्पादन कम कर देता है, और अंडे सेने से रोकता है. दीर्घायु विश्लेषण के लिए FUDR के उपयोग के वयस्क जीवन काल को प्रभावित नहीं करता है और हर कुछ दिनों कीड़े हस्तांतरण के क्रम में उन्हें बढ़ती लार्वा से अलग की जरूरत को हटाता है. प्लेटों के दोनों प्रकार के ई. के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं OP50 बैक्टीरिया कोलाई, जो बाद में यूवी के लिए जोखिम के मारे है .
भाग 2: एक समय पर अंडे बिछाने एक उम्र सिंक्रनाइज़ पशुओं की जनसंख्या प्राप्त करें
इस अनुभाग में हम एक आम हैच की तारीख के साथ कीड़े की आबादी उत्पन्न करते हैं. यह reproductively सक्रिय वयस्कों के समय का एक निर्धारित अवधि के लिए एक थाली पर अंडे देना करने के लिए अनुमति और उन अंडों को विकसित करने के लिए अनुमति देता है के द्वारा पूरा किया है.
भाग 3: जीवन अवधि के लिए कुल जानवरों
इस अनुभाग में हम भाग 2 से उम्र सिंक्रनाइज़ कीड़े की आबादी का पालन करें जब तक वे मर जाते हैं. कीड़े Amp / FUDR प्लेटों पर रखा जाता है अंडा उत्पादन और बैक्टीरियल संदूषण रोकने के लिए और मर चुके हैं माना जाता है जब वे असफल बाह्य stimuli का जवाब.
भाग 4: प्रतिनिधि परिणाम.
एक निमेटोड जीवन काल प्रयोग द्वारा उत्पादित कच्चे डेटा कीड़े कि जीवित है और प्रत्येक परीक्षण तनाव के लिए मर कर रहे हैं की इसी संख्या के साथ तारीखों की एक सूची है. कीड़े कि प्रत्येक दिन मर जाते हैं की संख्या आमतौर पर प्रत्येक दिन जीवित कीड़े के अनुपात (2A चित्रा), जो graphically एक अस्तित्व वक्र (चित्र 2B के रूप में प्लॉट है की गणना करने के लिए उलटा है, समय पर अंडे बिछाने के दिन 0 दिन माना जाता है ). अध्ययन में प्रत्येक व्यक्ति कीड़ा के लिए जीवन काल कीड़े कि प्रत्येक दिन मर जाते हैं की गिनती से गणना की जा सकती है और उपभेदों के बीच तुलना के लिए मतलब है और औसत जीवन अवधि की गणना के लिए इस्तेमाल किया. प्रत्येक दिन पर जीवित कीड़े की संख्या की गिनती सीधे जीवन काल विश्लेषण में उपयोग नहीं किया है. ठोस मीडिया पर बनाए रखा कीड़े कभी कभी 'पलायन' होगा, या मीडिया के नीचे थाली या नीचे की दीवार के ऊपर या तो क्रॉल. प्रत्येक दिन पर जीवित कीड़े की संख्या निर्धारित करने के लिए कितने कीड़े प्रयोग के पाठ्यक्रम में भाग गए करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कीड़े कि पलायन आम तौर पर विश्लेषण से हटा रहे हैं. एक बेंचमार्क के रूप में, ठेठ N2, सी. के लिए औसत जीवन काल एलिगेंस जंगली प्रकार तनाव, 20 यूवी मारे बैक्टीरिया पर बनाए रखा ° सी में लगभग 25 दिनों के रूप में अंडे से मापा है.
भाग 5: समाधान
| निमेटोड ग्रोथ (एन जी एम) मीडिया, 100 एमएल: | |
| हारवेस्टर: | |
| 0.3 छ | NaCl |
| 0.25 छ | Peptone |
| 2 जी | अग्रवाल |
| आटोक्लेव 40 मिनट के लिए और 55 से ठंडा डिग्री सेल्सियस, तो जोड़: | |
| 100 μL | 1 एम MgSO 4 |
| 100 μL | 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल |
| 100 μL | 1 एम CaCl2 |
| 1.625 एमएल | 1.5 एम KPI 6.0 पीएच |
| एन जी एम तरल तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है प्लेटें डाल या जमना करने की अनुमति दी और कमरे के तापमान पर लंबे समय तक संग्रहीत | |
| Luria (पौंड) शोरबा, 1L: | |
| 10 छ | BactoTryptone |
| 5 छ | खमीर निकालें |
| 10 छ | NaCl |
| 10 एमएल | 1 एम Tris पीएच 8.0 |
| 1 एल | विआयनीकृत जल |
| आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| 1 एम MgSO 4, 300 एमएल: | |
| 73.95 छ | 4 MgSO |
| 300 एमएल | विआयनीकृत जल |
| आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 200 एमएल: | |
| 1 ग्राम | कोलेस्ट्रॉल |
| 200 एमएल | 100% इथेनॉल |
| बाँझ फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| एम 1 2 CaCl, 500 एमएल: | |
| 27.75 छ | 2 CaCl |
| 500 एमएल | विआयनीकृत जल |
| बाँझ फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| 1.5 एम KPI 6.0 पीएच, 1L: | |
| हारवेस्टर: | |
| 31.4 छ | KPI dibasic |
| 179.6 छ | KPI तनहा नींव का |
| 850 एमएल | विआयनीकृत जल |
| हीट जबकि KPI समाधान में भंग करने के लिए अनुमति देने के मिश्रण. 6,0 करने के लिए 10 एन NaOH साथ पीएच को समायोजित करें. | |
| 1 एल विआयनीकृत जल जोड़ें | |
| आटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| एम 1 Tris, 8.0 पीएच: | |
| 60.57 छ | Tris |
| 400 एमएल | विआयनीकृत जल |
| एचसीएल के साथ 8.0 के पीएच को समायोजित करें. | |
| 500 एमएल विआयनीकृत जल जोड़ें. | |
| बाँझ फ़िल्टर कमरे के तापमान पर दुकान. | |
| 150 मिमी (FUDR) Fluorodeoxyuridine, 10 एमएल: | |
| 0.३,६९३ जी | FUDR |
| 10 एमएल | बाँझ विआयनीकृत पानी |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| 100 मिलीग्राम / एमएल (एएमपी) एम्पीसिलीन, 10 एमएल: | |
| 1 ग्राम | एम्पीसिलीन |
| 10 एमएल | बाँझ विआयनीकृत पानी |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| 50 मिलीग्राम / एमएल (Carb) Carbenicillin, 10 एमएल: | |
| 500 मिलीग्राम | Carbenicillin |
| 10 एमएल | बाँझ विआयनीकृत पानी |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
| एम 1 Isopropyl (IPTG) β-D-Thiogalactopyranoside, 10 एमएल: | |
| 2.38 छ | IPTG |
| 10 एमएल | बाँझ विआयनीकृत पानी |
| -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर | |
चित्रा 1 सी. के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एलिगेंस अंडे सहित जीवन के चरणों,, चार लार्वा (L1 - L4) चरणों, और वयस्क . सभी पैनल के अलावा निचले सही है, जो एक वयस्क पुरुष (लकड़ी (1988) से छवि) से पता चलता है hermaphrodites दिखा.
चित्रा 2 से एक सी. प्रतिनिधि परिणाम एलिगेंस जीवन अवधि प्रयोग daf-2 जीन में उत्परिवर्तन वाले तनाव को जंगली प्रकार तनाव N2 की तुलना . (ए) एक तालिका दिखा दिनों की संख्या के बाद से कीड़े के अंडे थे सहित एकत्रित किए गए डेटा, प्रत्येक दिन पर मनाया मृत कीड़े की संख्या, प्रतिशत और मूल नमूने के प्रत्येक दिन पर जीवित शेष (के रूप में मृत कीड़े के दैनिक मायने रखता है से गणना) . (बी) जीवन रक्षा जीवन काल (ए) में उपलब्ध कराए गए आंकड़ों के लिए इसी घटता.
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दीर्घायु के आनुवंशिक नियंत्रण सी. में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है एलिगेंस, मोटे तौर पर आसानी और तेज़ी के साथ जो जीवन काल निर्धारित किया जा सकता की वजह से. इस लेख में चर्चा प्रोटोकॉल सी. में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जीवन काल डेटा प्राप्त करने के लिए एक बुनियादी ढांचे का वर्णन एलिगेंस और भी relatednematode प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है इन प्रक्रियाओं के लिए स्थितियों की एक किस्म के तहत जीवन अवधि को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कुछ सरल परिवर्तन करके. 2. यहाँ हम जीवित बैक्टीरिया, शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई), बैक्टीरियल अभाव द्वारा आहार प्रतिबंध, और दवा मुक्त एन जी एम सहित कई आम भिन्नरूपों, चर्चा करेंगे.
इस प्रोटोकॉल से शायद सबसे आम परिवर्तन जीवित बैक्टीरिया पर कीड़े के रखरखाव है. यह कुछ मामूली परिवर्तन करने के द्वारा पूरा किया जा सकता है. सबसे पहले, बैक्टीरिया (1.13 माध्यम से 1.7 कदम) के साथ प्लेटें बोने के लिए प्रक्रिया बदल जाते हैं. संतृप्ति के लिए OP50 संस्कृतियों से बढ़ के बजाय, मध्य लॉग चरण और विंदुक 200 μL प्लेटों पर सीधे बढ़ने तरल संस्कृति से. बैक्टीरिया प्लेटों पर ऊपर बढ़ने रात में और यूवी के लिए जोखिम चूकना दें. एम्पीसिलीन FUDR साथ प्लेटों से भी बाहर रखा जाना चाहिए. जीवित बैक्टीरिया का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह है कि कीड़े के रूप में अक्सर नई प्लेटों के लिए हस्तांतरित किया जा नहीं है, के बाद से बैक्टीरिया भोजन जीवित है और बढ़ रहा है. जीवित बैक्टीरिया भोजन के नुकसान यह है कि OP50 सी. रोगजनक है एलिगेंस 3 कीड़े जीवित बैक्टीरिया पर हो यूवी मारे बैक्टीरिया, 3 जो संभवतः जीवन काल उम्र बढ़ने के साथ जुड़े phenotypes मुखौटा सकता है पर हो कीड़े की तुलना में एक छोटी अवधि रहते है . जीवित बैक्टीरिया पर माध्य जीवन काल लगभग 20 दिन है.
आरएनएआई द्वारा नीचे दस्तक जीन आसानी से सी में निपुण है उनके बैक्टीरिया भोजन संशोधित इतना है कि यह डबल असहाय आरएनए जीन नीचे गिरा दिया जा करने के लिए इसी का उत्पादन द्वारा एलिगेंस. दो आरएनएआई बैक्टीरियल पुस्तकालयों में उपलब्ध हैं कि सी में खुला पढ़ने फ्रेम के 90% से अधिक कवर एलिगेंस जीनोम. 4-9 जीवन काल के संदर्भ में आरएनएआई उपयोग करने के लिए, ब्याज की आरएनएआई क्लोन के साथ OP50 बैक्टीरिया की जगह और जीवित बैक्टीरिया पर जीवन काल को मापने के लिए पिछले पैराग्राफ में चर्चा की संशोधनों का पालन करें. आरएनएआई पुस्तकालयों एक प्लाज्मिड आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें. प्लाज्मिड carbenicillin प्रतिरोध कैसेट और डबल असहाय शाही सेना की अभिव्यक्ति है isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) से प्रेरित का उपयोग करने के लिए चुना है. दोनों carbenicillin और IPTG एन जी एम प्लेटों में शामिल किया जाना चाहिए. प्रति 100 एमएल एन जी एम के 100 μL 1 एम IPTG और 50 μL 50 मिलीग्राम / एमएल carbenicillin प्लेटों के दोनों प्रकार के लिए जोड़ने द्वारा 1.4 कदम संशोधित. एम्पीसिलीन थाली के किसी भी प्रकार के लिए जोड़ा जा, क्योंकि carbenicillin वही भूमिका को पूरा जरूरत नहीं है.
आहार प्रतिबंध evolutionarily मुक़्तलिफ़ प्रजातियों भर में उम्र बढ़ने धीमा करने के लिए सबसे व्यापक रूप से अध्ययन हस्तक्षेप है. सी. में एलिगेंस, ठोस मीडिया पर अधिकतम जीवन अवधि विस्तार जब बैक्टीरिया भोजन स्रोत पूरी तरह से वयस्कता के दौरान हटा दिया जाता है मनाया जाता है, आहार प्रतिबंध के एक फार्म बैक्टीरियल अभाव करार दिया (बी) 9, बी.डी. के संदर्भ में जीवन अवधि को मापने के 10, दो संशोधन करने. उपरोक्त प्रोटोकॉल. सबसे पहले, प्लेट की एक तीसरे प्रकार तैयार करते हैं. ये प्लेटें बैक्टीरिया भोजन स्रोत की कमी के अलावा Amp FUDR / प्लेटों के समान होना चाहिए. दूसरा, 3 भाग को संशोधित करने के लिए 3.2 कदम है और 3.3 कदम के बीच एक अतिरिक्त कदम शामिल हैं. वयस्कता के 4 दिन (4 दिन / Amp FUDR L4 लार्वा स्थानांतरित करने के बाद) पर स्थानांतरण Amp / FUDR प्लेटें बी.डी. कीड़े बैक्टीरिया की कमी. एक आहार प्रतिबंध के इस फार्म के के साथ जुड़े जटिलता 'कीड़े भागने की प्रवृत्ति है. भोजन के अभाव में कीड़े प्लेट के केन्द्र के निकट नहीं रहना है, लेकिन भोजन की तलाश में उनके अन्वेषण के क्षेत्र में वृद्धि होगी. एक परिणाम के रूप में, कीड़े का एक बड़ा अंश थाली और कुम्हलाना की दीवारों क्रॉल जाएगा. हम अक्सर देखते हैं 50 से पशुओं के 70% बी.डी. प्लेटों को हस्तांतरित किया जा रहा है के बाद भागने. इस मुद्दे के समाधान के लिए, कई कीड़े के रूप में तीन बार के साथ शुरू करने के लिए एक महत्वपूर्ण संख्या है उड़ान के बाद प्लेटों पर शेष है. बी.डी. भी कोई अतिरिक्त संशोधनों, या आरएनएआई के साथ एक अतिरिक्त संशोधन के साथ के साथ जीवित बैक्टीरिया भोजन के साथ संयुक्त किया जा सकता है. आरएनएआई के साथ बी.डी. के लिए, एक अतिरिक्त एंटीबायोटिक बैक्टीरिया के बिना प्लेटों के लिए जोड़ा जाना चाहिए करने के लिए बढ़ रही है और एक अवांछित खाद्य स्रोत प्रदान से कीड़े के साथ स्थानांतरित बैक्टीरिया को रोकने. दो उदाहरण टेट्रासाइक्लिन और kanamycin, जो या तो 1.4 चरण के दौरान बैक्टीरिया भोजन के बिना FUDR प्लेट को जोड़ा जा सकता है. बी.डी. वयस्कता की 2 दिन या के रूप में वयस्कता के 14 दिनों के रूप में देर के रूप में जल्दी के रूप में भी शुरू किया जा सकता है, जीवन काल पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ 10.
अंतिम संशोधन है कि हम चर्चा करेंगे एन जी एम प्लेटों पर अतिरिक्त दवाओं (जैसे एम्पीसिलीन या FUDR) के बिना जीवन अवधि को मापने है. यह पूरा किया जा सकता हैचरण 4 के दौरान एन जी एम के लिए बस नहीं जोड़ने दवाओं और भाग 3 में एक अतिरिक्त कदम जोड़ने के द्वारा. FUDR बिना कीड़े अंडे बिछाने और लार्वा उत्पादन जारी रहेगा. उनके प्रजनन चरण के दौरान (लगभग वयस्कता के पहले सप्ताह) सभी प्रयोगात्मक कीड़े ताजा प्लेटों को हर 2 दिन हस्तांतरित किया जा करने के लिए उन्हें उनके वंश से अलग होगा.
सी एलिगेंस मुख्य रूप से पुरुषों की दुर्लभ घटना के साथ उभयलिंगी हैं. जीवन अवधि आमतौर पर केवल hermaphrodites के लिए मापा जाता है, लेकिन यह भी पुरुषों के लिए मापा जा सकता है है. वहाँ दो पुरुष सी. के साथ काम करने के साथ जुड़े चुनौतियों का सामना कर रहे हैं एलिगेंस. पहले पुरुष कीड़े की एक बड़ी मात्रा प्राप्त है, के रूप में स्व निषेचन उभयलिंगी पुरुष वंश का एक बहुत छोटा अंश (0.1%) का उत्पादन 11. एक बार एक पुरुष कीड़े युक्त जनसंख्या को उपलब्ध हो जाता है, पुरुष / द्विलिंग संभोग पुरुषों की संख्या लगभग बराबर का उत्पादन और कीड़े के रूप में लंबे समय के रूप में hermaphrodites भोजन की उपस्थिति में रखा जाता है. 12 पुरुष शेयरों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र से आदेश दिया जा सकता है या नेत्रहीन संस्थापक उभयलिंगी स्व निषेचन से उत्पादन पुरुषों के लिए स्क्रीनिंग के द्वारा उत्पन्न. दूसरी चुनौती पुरुष सफाई व्यवहार है. या तो खाना या संभावित साथी (hermaphrodites) की अनुपस्थिति में, पुरुष कीड़े एक खोज व्यवहार मोड कि आंदोलन की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है में प्रवेश 13. प्लेटों पर दीवारों भागने प्लेट कीड़े का एक बड़ा अंश में इस व्यवहार के परिणामों को बनाए रखा और desiccating . इस मुश्किल से निपटने के लिए सामान्य विधि है बस पर्याप्त पुरुषों है कि एक पर्याप्त संख्या में रहने के बाद सबसे अधिक भाग गए हैं के साथ शुरू.
जीवन काल के अलावा, एक आम उम्र जुड़े phenotype lipofuscin संचय है. Lipofuscin जटिल सेलुलर अपशिष्ट कि अपमानित नहीं जा सकता है कि उम्र के साथ कोशिकाओं में बनाता है और सी. में उम्र बढ़ने के एक biomarker के रूप में प्रयोग किया जाता है है एलिगेंस 14, 15, lipofuscin fluoresces और सी. में आसानी से देखे जा सकते हैं एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की DAPI चैनल (चित्रा 3) का उपयोग एलिगेंस . Lipofuscin संचय सीधे एन जी एम प्लेटों पर जीवन काल के लिए बनाए जा रहा है कीड़े में visualized हो सकता है, जीवन काल के साथ समानांतर में एक उपयोगी माध्यमिक phenotype के संग्रह की अनुमति कर सकते हैं.
जीवन काल के अलावा, इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल भी सी. में उम्र जुड़े पक्षाघात के प्ररूपी प्रगति का स्कोर किया जा सकता है proteotoxicity रोग के एलिगेंस मॉडल 16. जब एक कीड़ा झोले के मारे हुए यह थाली भर में क्रॉल करने में असमर्थ हो जाता है, लेकिन अभी भी अपने सिर को स्थानांतरित कर सकते हैं हो जाता है. बने है एक कीड़ा के रूप में झोले के मारे हुए अगर यह थाली दोहन या एक प्लैटिनम हस्तांतरण लेने के साथ उकसाने के जवाब में एन जी एम के सापेक्ष ले जाने के विफल रहता है, लेकिन अपने सिर को स्थानांतरित करता है. कीड़े कि आम तौर पर मर जाते हैं कि वे सबसे हाल ही रहते अवलोकन के दौरान दिए गए पक्षाघात (झोले के मारे हुए या नहीं झोले के मारे हुए) स्कोर बनाए रखने. महत्वपूर्ण बात है, यहां तक कि जंगली प्रकार सी. एलिगेंस उन्नत उम्र के साथ रुक हो गया है. के लिए इस कारण पक्षाघात आमतौर पर लगभग 20 दिनों की तुलना में पुराने के रूप में इस बिंदु से परे कीड़े, के लिए रन नहीं है यह सामान्य उम्र बढ़ने और proteotoxicity रोग की प्रगति के कारण पक्षाघात के कारण पक्षाघात के बीच भेद करना मुश्किल हो जाता है.
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यह काम जरा विज्ञान पुरस्कार और NIH MKGS 1R01AG031108-01 एनआईएच प्रशिक्षण P30AG013280 अनुदान द्वारा समर्थित है अनुदान में / ग्लेन दूर सफलताओं के द्वारा समर्थित किया गया था. एम के एक एलिसन एजिंग में मेडिकल फाउंडेशन नई विद्वान है.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Ampicillin | Reagent | MidSci | 0339 | |
| BactoTryptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| BactoPeptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | Reagent | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| Carbenicillin | Reagent | Gold Biotechnology | C0109 | |
| Cholesterol | Reagent | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Reagent | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| KPi Dibasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| KPi Monobasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | Reagent | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
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ReplyPosted by: NeerajaJune 23, 2010, 11:46 AM