Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Parte 1: Prepare nematóide crescimento media (NGM) placas

Esta seção descreve a preparação das placas NGM sólido para uso no experimento vida. A experiência de extensão básicas da vida requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e Amp / FUDR placas, que têm ampicilina (Amp) e fluorodeoxyuridine (FUDR) adicionado ao NGM. Ampicilina é usado para prevenir a contaminação bacteriana estrangeiros. FUDR inibe a divisão celular, reduz a produção de ovos, e impede que os ovos de incubação. O uso de FUDR para a análise da longevidade não afeta expectativa de vida de adultos e elimina a necessidade de transferência de worms cada poucos dias, a fim de separá-los de larva a crescer. Ambos os tipos de placas são semeados com E. coli OP50 bactérias, que é posteriormente morto por exposição a UV.

1. Prepare NGM (ver secção 5 para receita e notas de armazenamento) e placas de petri rótulo. Você vai precisar de uma placa de petri 60 milímetros por 10 mL de NGM. Se você está começando com previamente preparado NGM sólida, avance para o passo 1.2. Se você está começando com NGM recém autoclavado, pule para o passo 1.4.
2. Derreter completamente NGM sólido por microondas em alta em 30 pulsos segundo. Media redemoinho entre os pulsos para evitar bolhas de gás pressurizado de edificação.
3. NGM lugar líquido em 55 ° C ou banho de água na bancada para esfriar.
4. Uma vez que NGM atinge 55 ° C adicionar 33 mL de 150 FUDR mM e 100 mL de 100 mg / mL por 100 mL Ampicilina NGM (para Amp / FUDR placas) e agite para misturar. Para placas NGM sem drogas adicionais prosseguir diretamente para o passo 1.5.
5. Utilizando uma técnica estéril, pipetar 10 mL em cada placa NGM petri 60 mm. Evite a formação de bolhas, se possível. Se as bolhas se formam, elas podem ser estalado usando uma ponta da pipeta.
6. Deixar as placas sobre a bancada com tampas para permitir NGM para solidificar e seco. Se possível, deixe as placas no banco por 2 dias antes da adição de bactérias, mas um dia vai funcionar se as placas são necessários mais cedo.
7. No dia antes de terminar a secagem das placas, a semente da cultura LB líquido com uma única colônia a partir de uma raia fresca de E. coli OP50 bactérias em agar LB. Você deve preparar, pelo menos, 1 mL de uma cultura OP50 noite por 60 placa mm.
8. Cultura local OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam overnight (a cultura deve atingir a saturação).
9. Pellet OP50 bactérias girando a 3.500 g por 10 minutos.
10. Remover 90% das bactérias sobrenadante e ressuspender concentrar cultura 10x.
11. Pipetar 100 mL da cultura 10x OP50 concentrada no centro de placas NGM solidificado. Placas agite cuidadosamente para espalhar cultura de bactérias se necessário (o ideal bactérias deve cobrir a área central da NGM sem chegar perto das muralhas da placa). Tente evitar tocar a ponta da pipeta na superfície da NGM, como falhas na superfície dos meios de comunicação permitirá que as minhocas burrow na NGM.
12. Deixe placas no banco durante a noite para permitir cultura de bactérias para secar na NGM sólido (normalmente demora cerca de 24 horas).
13. Depois de seco, expor a superfície das placas a uma dose UV suficiente para deter o crescimento das bactérias. Se você estiver usando uma Stratalinker UV Stratagene 2400:
    • Placas lugar no Stratalinker e remover as tampas
    • Feche a porta e ligar o Stratalinker
    • "Energia" de imprensa
    • Digite '9999 'usando o teclado
    • 'Start' imprensa
    • As placas serão expostos aos raios UV por aproximadamente 5 minutos
14. Placas com as bactérias UV-morto pode ser armazenado de cabeça para baixo a 4 ° C por até 1 mês.

Parte 2: Executar um ovo cronometrados que estabelece uma idade para a aquisição sincronizada população de animais

Nesta seção, vamos gerar uma população de vermes com uma data comum hatch. Isto é conseguido, permitindo que adultos reprodutivamente ativos para colocar ovos em um prato por um período definido de tempo e permitindo que os ovos se desenvolvam.

1. (Opcional) Transferência de aproximadamente 20 vermes adultos jovens a uma placa NGM fresca sem FUDR. Deixar as placas a 25 ° C, a fim de permitir que worms se propaguem e comer através de todos os alimentos bacteriana. Depois que o alimento foi consumido bacteriana worms recém-nascidos vai entrar no estágio de crescimento preso Dauer. Você começará a ver larva Dauer em torno de uma semana, dependendo de quantos worms você transferir para a placa inicialmente. Dauer larva pode ser usado para as próximas etapas para até um mês.
2. (Opcional) Transferência larva Dauer 20-30 a uma placa NGM fresca sem FUDR. Na presença de larva de alimentos se tornarão adultos Dauer reprodutivamente ativa dentro de 2 dias e manter-se reprodutivamente ativa por alguns dias depois a 25 ° C.
3. Transferência de 10-15 adultos reprodutivamente ativa para uma placa NGM fresca sem FUDR. Esta placa é referida como a postura de ovos cronometrado (TEL) da placa.
4. Deixe a placa TEL a 25 ° C durante 6 horas, a fim de permitir que tele worms tempo para botar ovos.
5. Remover vermes adultos de placa TEL. Placa pode ser inspeccionados visualmente para os ovos antes de remover os adultos. Se os vermes não tenham estabelecido um número suficiente de ovos a placa TEL podem ser deixados a 25 ° C por até um total de 24 horas antes de retirar vermes adultos.
6. Colocar a placa TEL a 20 ° C até que os ovos eclodiram e os vermes desenvolveram ao estágio larval L4 (o que normalmente leva 2 dias para tipo selvagem C. elegans, mas pode demorar mais tempo para as cepas com fenótipos de desenvolvimento lento).

Parte 3: animais Partituras de vida

Nesta seção, siga as idade sincronizado população de vermes na parte 2 até morrerem. Worms são mantidos em Amp / FUDR placas para impedir a produção de ovos ea contaminação bacteriana e são considerados mortos quando não conseguem responder a estímulos externos.

1. Transferência de larva L4 para semeado Amp / FUDR placas. Para cada estirpe ou condição a ser testada, é típico para configurar 2-3 placas com 25-30 worms por placa. Imagens da C. fases da vida elegans são fornecidos para a referência (Figura 1) ^1.
2. Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C por 24 horas.
3. Após 24 horas, visualmente avaliar worms, mídia e bactérias. Transferência de worms para fresco Amp / FUDR placas se qualquer um dos seguintes é observado:
   • Worms ter comido a maior parte dos alimentos bacteriana. No início da vida worms experimento extensão terá de ser transferida 1-2 vezes por semana para evitar que as bactérias fossem esgotados.
   • Um número significativo de larvas estão presentes. Isso geralmente é uma indicação de que os vermes foram transferidos para as placas Amp / FUDR como jovens adultos, em vez de L4s e foram capazes de colocar alguns ovos antes da FUDR entrou em vigor. O FUDR geralmente impedir que as larvas se transformem em adultos completa, mas, ocasionalmente, alguns vão se transformar em adultos e se confundem com os animais experimentais.
   • Bactérias vivas / crescentes são observadas. Geralmente, a combinação de Amp e UV-matança vai garantir que nenhuma bactéria contaminar viver a experiência, mas ocasionalmente ocorre.
   • Crescimento do fungo é observada na mídia. Se detectada a tempo, o crescimento de fungos geralmente podem ser cortadas usando uma ponteira ou espátula. Uma vez que cresce a ser maior do que alguns milímetros de diâmetro é geralmente mais fácil de transferir os vermes para um novo prato.
   • Usando o escopo de dissecação, determinar se cada um worm é vivo ou morto.
   • Bata suavemente a placa. O worm é vivo se move em resposta ao toque.
   • Se o worm não responde a tocar a placa de zoom, em na região da cabeça.
   • Bata suavemente a cabeça do verme com pick transferência de platina. Pontuação o worm como morto, se ele não responder movendo a cabeça.
   • Worms mortos pode ser removido da placa.
4. Registrar a data eo número de vermes que estão vivos e mortos.
5. Retorno placas a 20 ° C.
6. Repita os passos 3,3 a 3,6 a cada 2 a 3 dias até que todos os vermes já morreram.

Parte 4: Resultados Representante.

Os dados brutos produzidos por um período de experiência de nematóides de vida é uma lista de datas com números correspondentes de vermes que estão vivos e mortos para cada cepa testada. O número de worms que morrem em cada dia é tipicamente invertido para calcular a proporção de vermes vivos em cada dia (Figura 2A), que é plotado graficamente como uma curva de sobrevivência (Figura 2B, o dia da postura de ovos cronometrado é considerado dia 0 ). O tempo de vida para cada verme individuais no estudo pode ser calculado a partir da contagem de vermes que morrem em cada dia e usado para calcular tempo de vida média e mediana para a comparação entre as linhagens. A contagem do número de vermes vivos em cada dia não é utilizado diretamente na análise de ciclo de vida. Worms mantidos em meios sólidos irá ocasionalmente 'fugir', ou rastrear tanto para cima da parede da placa ou para baixo abaixo da media. O número de vermes vivos em cada dia pode ser usado para determinar quantos worms fugiram durante todo o curso do experimento. Worms que fogem são normalmente removidos da análise. Como referência, o tempo de vida típico mediana para N2, a C. elegans cepa do tipo selvagem, mantidos em UV-matou as bactérias a 20 ° C é de aproximadamente 25 dias, como medida de ovo.

Parte 5: Soluções

Figura 1. Brilhante imagens campo de C. fases da vida elegans, incluindo ovo, quatro estágios larvais (L1 - L4) e adultos. Todos os painéis mostram hermafroditas, exceto o inferior direito, o que mostra um homem adulto (Imagem de Wood (1988)).

Figura 2. Os resultados representativos de um C. elegans experimento tempo de vida comparando N2 linhagem selvagem tipo para uma cepa que contém uma mutação no gene daf-2. (A) Uma tabela mostrando os dados coletados, incluindo o número de dias desde worms foram ovos, número de vermes mortos observadas em cada dia, ea porcentagem da amostra original permanecer vivo em cada dia (como calculado a partir da contagem diária de vermes mortos) . (B) Survival curvas correspondentes aos dados de tempo de vida previsto no (A).

Figura 3. Comparação Representante da lipofuscina entre jovens e velhos adulto C. elegans. Imagens de campo claro são mostrados à esquerda e as imagens de fluorescência DAPI canal à direita. Painéis superiores mostram um verme 4 dias de idade e painéis de fundo mostram um worm de 11 dias de idade (medida a partir de ovo).

O controle genético da longevidade tem sido estudado extensivamente em C. elegans, em grande parte devido à facilidade e rapidez com que expectativa de vida pode ser determinada. O protocolo discutido neste artigo descreve uma estrutura básica para a obtenção de dados de vida reprodutíveis extensão em C. elegans e também pode ser aplicado às espécies relatednematode. ² Ao fazer algumas alterações simples desses procedimentos pode ser adaptado para medir a expectativa de vida sob uma variedade de condições. Aqui vamos discutir várias variações comuns, incluindo bactérias vivas, interferência de RNA (RNAi), a restrição alimentar pela privação bacteriana, e livre de drogas NGM.

Provavelmente, a variação mais comum a partir deste protocolo é a manutenção de worms em bactérias vivas. Isto pode ser conseguido fazendo algumas pequenas alterações. Em primeiro lugar, alterar o procedimento para a semeadura as placas com as bactérias (passos 1,7 por 1,13). Ao invés de crescer OP50 culturas da saturação, crescer para log-mid fase e pipetar 200 mL para as placas diretamente da cultura líquida. Permitir que as bactérias cresçam nas placas durante a noite e omitir a exposição ao UV. Ampicilina deve ser igualmente excluídas as placas com FUDR. Uma vantagem de usar bactérias vivem é que os worms não precisam ser transferidos com a freqüência de novas placas, desde que o alimento é bacteriana viva e crescente. A desvantagem de alimentos bacteriana ao vivo é que OP50 é patogênico para C. elegans. ³ Worms cultivados em bactérias vivas têm um curto espaço vivo do que worms cultivadas em UV-morto bactérias, ^3, que poderia mascarar fenótipos tempo de vida associados ao envelhecimento. Expectativa de vida mediana em bactérias vivas é de aproximadamente 20 dias.

Gene knock down por RNAi é facilmente realizado em C. elegans, modificando seu alimento de bactérias para que produza double-stranded RNA correspondente ao gene a ser derrubado. Duas bibliotecas RNAi bacteriana estão disponíveis, que cobrem mais de 90% dos quadros de leitura aberta na C. elegans genoma. ^4-9 Para utilizar RNAi no contexto do ciclo de vida, substitua o OP50 bactérias com o clone RNAi de interesse e acompanhar as modificações discutidas no parágrafo anterior para medir a expectativa de vida de bactérias vivas. As bibliotecas RNAi usar um sistema de expressão de plasmídeo baseado. O plasmídeo é selecionado para utilizar uma cassete de resistência carbenicilina e expressão do RNA dupla fita é induzida por isopropílico β-d-thiogalactopyranoside (IPTG). Ambos carbenicilina e IPTG precisam ser incluídos nas placas NGM. Modificar o passo 1,4 por adição de 100 L 1 M IPTG e 50 mL 50 mg / mL carbenicilina por 100 mL NGM a ambos os tipos de pratos. Ampicilina não precisam ser adicionados a qualquer tipo de prato, desde carbenicilina cumpre o mesmo papel.

Restrição alimentar é a intervenção mais amplamente estudada para retardar o envelhecimento através das espécies evolutivamente divergentes. Em C. elegans, a extensão máxima extensão de vida em meio sólido é observado quando a fonte de alimento de bactérias é completamente removido durante a idade adulta, uma forma de restrição alimentar denominado privação bacteriana (BD). ^{9, 10} Para medir a expectativa de vida no contexto da BD, fazer duas modificações com o protocolo acima. Primeiro, prepare um terceiro tipo de prato. Essas placas devem ser idênticas às placas Amp / FUDR exceto faltando a fonte de alimento de bactérias. Em segundo lugar, modificar Parte 3 de incluir uma etapa adicional entre 3,2 e passo passo 3.3. No 4 º dia da vida adulta (4 dias após a transferência das larvas L4 de Amp / FUDR) worms transferência de BD para Amp / FUDR placas falta bactérias. Uma complicação associada com esta forma de restrição alimentar é a worms "tendência a fugir. Na ausência de alimentos os vermes não vai ficar perto do centro do prato, mas vai aumentar a sua área de exploração em busca de comida. Como resultado, uma fração maior dos vermes irão trepar as paredes do prato e desidratar. Muitas vezes vemos 50% a 70% dos animais fugir depois de ser transferido para placas de BD. Para abordar esta questão, começar com três vezes mais worms muitos, a fim de ter um número significativo restantes nas placas pós-vôo. BD também pode ser combinado com o alimento de bactérias vivem sem modificações adicionais, ou com RNAi com uma modificação adicional. Para BD com RNAi, um antibiótico adicional deve ser adicionado às placas sem bactérias impedir que as bactérias transferidas com os vermes de crescer e proporcionar uma fonte de alimento não desejados. Dois exemplos são a tetraciclina e canamicina, um dos que podem ser adicionados às placas bacterianas FUDR sem comida durante o passo 1.4. BD também pode ser iniciado o mais cedo dois dias da vida adulta, ou tão tarde quanto 14 dias de idade adulta, sem impacto significativo na vida. ¹⁰

A modificação final que vamos discutir é medir tempo de vida em placas NGM sem drogas adicionais (por exemplo, ampicilina ou FUDR). Isso pode ser feitosimplesmente não a adição dos fármacos para a NGM durante o passo 4 e adicionando um passo adicional na parte 3. Sem FUDR os vermes continuará produzindo ovos e larva. Durante a sua fase reprodutiva (aproximadamente uma semana o primeiro da vida adulta) todos os worms experimental terá que ser transferidos para placas fresco a cada 2 dias para separá-los de sua prole.

C. elegans são principalmente hermafrodita, com rara ocorrência de machos. Expectativa de vida é tipicamente medido para hermafroditas apenas, mas também pode ser medida para os homens. Existem dois desafios associados com o trabalho com C. masculino elegans. A primeira é a aquisição de uma grande quantidade de vermes machos, como hermafroditas auto-fertilização produz uma fração muito pequena dos descendentes do sexo masculino (0,1%). ¹¹ Uma vez que uma população contendo vermes machos é atingida, masculino / hermafrodita acasalamento produz um número aproximadamente igual de homens e hermafroditas, enquanto worms são mantidos na presença de alimentos. Masculino ¹² estoques pode ser encomendado a partir do Centro de Genética Caenorhabditis ou gerados por triagem visual para os homens fundação hermafrodita produzido a partir de auto-fertilização. O segundo desafio é o comportamento de limpeza do sexo masculino. Na ausência de comida ou parceiros em potencial (hermafroditas), vermes machos introduzir um modo de pesquisa comportamental que envolve uma ampla gama de movimentos. ¹³ Quando mantidos em placas esse comportamento resulta em uma grande fração dos vermes fugindo as paredes placa e ressecando . O método geral para lidar com esta dificuldade é simplesmente começar com os machos o suficiente para que um número substancial permanecem após a maioria ter fugido.

Além da expectativa de vida, um comum associado à idade fenótipo é o acúmulo de lipofuscina. Lipofuscina é desperdício celular complexa que não pode ser degradada que se acumula nas células com a idade e é usado como um biomarcador de envelhecimento em C. elegans. ^{14, 15} Lipofuscina fluoresce e pode ser facilmente visualizado em C. elegans utilizando o canal DAPI de um microscópio de fluorescência (Figura 3). Lipofuscina acúmulo pode ser visualizado na worms ser marcado para tempo de vida diretamente sobre as placas NGM, permitindo cobrança de um fenótipo útil secundária em paralelo com a vida.

Além de expectativa de vida, o protocolo descrito neste artigo também pode ser usado para marcar a progressão fenotípica de idade associada a paralisia em C. elegans modelos de doença proteotoxicity. ¹⁶ Quando um worm se torna paralisado, torna-se incapaz de atravessar a placa, mas ainda pode mover a cabeça. Um worm é classificada como paralisados ​​se não conseguir se mover em relação ao NGM em resposta a placa batendo ou estímulo com uma picareta de transferência de platina, mas não mover a cabeça. Worms que morrem geralmente mantêm a pontuação paralisia (paralisados ​​ou não paralisados) que elas foram dadas durante a observação mais recente viver. Importante, mesmo tipo selvagem C. elegans ficam paralisadas com idade avançada. Por esta razão, a paralisia não é tipicamente marcado para worms com mais de aproximadamente 20 dias, a partir deste ponto, torna-se difícil distinguir entre a paralisia causada pelo envelhecimento normal e paralisia causada por progressão da doença proteotoxicity.