Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på fasta medier

Del 1: Förbered rundmasken tillväxt media (NGM) plattor

Detta avsnitt beskriver förberedelserna av det fasta NGM plattorna för användning i livslängd experimentet. En grundläggande livslängd experiment kräver två typer av plattor: Standard NGM plattor, som innehåller inga tillsatser, och AMP / FUDR plattor, som har både ampicillin (Amp) och fluorodeoxyuridine (FUDR) läggs till NGM. Ampicillin används för att förhindra utländska bakteriell kontamination. FUDR hämmar celldelning, minskar äggproduktion, och förhindrar att ägg från kläckning. Användningen av FUDR för livslängd analys påverkas inte vuxen livslängd och eliminerar behovet av att överföra maskar var och varannan dag för att skilja dem från att växa larv. Båda typerna av plattor ympats med E. coli OP50 bakterier, som sedan dödas av exponering för UV.

1. Förbered NGM (se avsnitt 5 för recept och anteckningar lagring) och etikett plattor Petri. Du behöver ett 60 mm Petri plåt per 10 ml av NGM. Om du börjar med tidigare förberedda solida NGM fortsätter du till steg 1,2. Om du börjar med färsk autoklaveras NGM, gå till steg 1,4.
2. Helt smälta fast NGM med mikrovågsugnen på hög i 30 sekunder pulser. Swirl media mellan pulser för att förhindra trycksatt gas bubblor byggs upp.
3. Placera flytande NGM i 55 ° C vattenbad eller på bänken för att svalna.
4. När NGM når 55 ° C lägger 33 mikroliter av 150 mm FUDR och 100 mikroliter på 100 mg / ml Ampicillin per 100 ml NGM (för Amp / FUDR plattor) och snurra för att blanda. För NGM tallrikar utan extra droger gå direkt till steg 1,5.
5. Användning av steril teknik, Pipettera 10 ml NGM i varje 60 mm Petri platta. Undvik att bilda bubblor om det är möjligt. Om bubblor utgör, kan de spontant med hjälp av en pipettspetsen.
6. Låt plattorna stå med lock på att NGM stelna och torka. Om möjligt, låt plattorna bänk i 2 dagar innan du lägger till bakterier, men en dag kommer att fungera om plattorna behövs tidigare.
7. På dagen innan plattorna avsluta torkning, utsäde kultur flytande LB med en enda koloni från en ny strimma av E. coli OP50 bakterier på LB agar. Du bör förbereda minst 1 mL av en övernattning OP50 kultur per 60 mm platta.
8. Placera OP50 kultur i 37 ° C shaker och låta bakterier att växa över natten (kultur bör nå mättnad).
9. Pellets OP50 bakterier genom att snurra på 3500 gi 10 minuter.
10. Ta bort 90% av supernatanten och återsuspendera bakterier att koncentrera kultur 10x.
11. Pipettera 100 mikroliter av 10x koncentrerad OP50 kultur i centrum av stelnat NGM tallrikar. Snurra plattor försiktigt för att sprida ut bakteriekultur vid behov (helst bakterier bör omfatta centrala delen av NGM utan att komma nära plattan väggar). Försök att undvika att röra vid pipettspetsen till ytan på NGM, som brister i ytan av media tillåter maskar att krypa in i NGM.
12. Låt plattorna stå över natten så att bakteriekultur att torka på den solida NGM (typiskt tar cirka 24 timmar).
13. När torr, utsätta ytan av plattorna till en UV-dos är tillräcklig för att gripa tillväxten av bakterier. Om du använder en Stratagene UV Stratalinker 2400:
    • Placera plattorna i Stratalinker och ta bort lock
    • Stäng luckan och slå på Stratalinker
    • Tryck på "Energi"
    • Ange '9999 'med hjälp av knappsatsen
    • Tryck på "Start"
    • Plattorna kommer att utsättas för UV för ungefär 5 minuter
14. Plattor med UV-dödade bakterier kan lagras upp och ner vid 4 ° C i upp till 1 månad.

Del 2: Gör en tidsinställd äggläggning att förvärva en åldersrelaterad synkroniserad population av djur

I detta avsnitt vi genererar en befolkning på maskar med en gemensam lucka aktuell. Detta sker genom att reproduktivt aktiva vuxna att lägga ägg på en platta för en bestämd tid och låta äggen att utvecklas.

1. (Valfritt) Överför ca 20 unga vuxna maskar till ett nytt NGM tallrik utan FUDR. Lämna plattorna vid 25 ° C så att maskar att propagera och äta igenom alla bakteriella mat. Efter den bakteriella mat har konsumerats nykläckta maskar kommer in i tillväxt greps Dauer skede. Du kommer att börja se Dauer larv runt inom en vecka, beroende på hur många maskar du överför till plattan från början. Dauer larv kan användas för nästa steg i upp till 1 månad.
2. (Valfritt) Transfer från 20 till 30 Dauer larv till ett nytt NGM tallrik utan FUDR. I närvaro av föda Dauer larv blir reproduktivt aktiva vuxna inom 2 dagar och förblir reproduktivt aktiva under några dagar därefter vid 25 ° C.
3. Transfer från 10 till 15 reproduktivt aktiva vuxna till ett nytt NGM tallrik utan FUDR. Denna platta är kallad tidsinställda äggläggningen (TEL) plattan.
4. Lämna TEL plattan vid 25 ° C i 6 timmar så att tHan maskar dags att lägga ägg.
5. Ta bort vuxna maskar från Tel plattan. Tavla kan inspekteras visuellt för ägg innan du tar bort vuxna. Om maskarna inte har lagt tillräckligt många ägg TEL plattan kan lämnas vid 25 ° C i upp till totalt 24 timmar innan du tar bort vuxna maskar.
6. Placera TEL plattan vid 20 ° C tills äggen har kläckts och maskarna har utvecklats till L4 larvstadiet (det brukar ta två dagar för vild typ C. elegans, men kan ta längre tid för stammar med långsamma utveckling fenotyper).

Del 3: Betyg djur för livslängd

I detta avsnitt får vi följa en ålder-synkroniserade population av maskar från del 2 tills de dör. Maskar är upprätthålls på Amp / FUDR plattorna för att förhindra äggproduktion och bakteriell kontamination och anses vara död när de misslyckas med att reagera på yttre stimuli.

1. Överföring L4 larv till seedade Amp / FUDR plattor. För varje stam eller ett villkor som testas, är det typiskt att inrätta 2-3 plattor med 25-30 maskar per platta. Bilder av C. elegans livsstadier finns som referens (figur 1). ¹
2. Placera Amp / FUDR plattorna vid 20 ° C i 24 timmar.
3. Efter 24 timmar, visuellt bedöma maskar, media och bakterier. Överföring maskar till frisk Amp / FUDR plattor om något av följande observeras:
   • Worms har ätit de flesta bakteriella mat. Tidigt i livslängd experiment maskar kommer att överföras 1 till 2 gånger i veckan för att förhindra att bakterier från att vara utfiskade.
   • Ett stort antal larver är närvarande. Detta är vanligtvis en indikation på att maskarna överfördes till Amp / FUDR plattor som unga vuxna i stället för L4s och kunde lägga några ägg innan FUDR trädde i kraft. Den FUDR kommer i allmänhet att hindra larverna från att växa i full vuxna, men ibland ett fåtal kommer att växa till vuxna och bli förvirrad med försöksdjur.
   • Live / växande bakterier observeras. Generellt kommer kombinationen av Amp och UV-dödande säkerställa att inga levande bakterier förorena försöket, men ibland inträffar.
   • Svamptillväxt observeras på mediet. Om det upptäcks tidigt nog, kan svamptillväxt brukar skäras ut med hjälp av en pipett spets eller spatel. När det blir att vara större än några millimeter i diameter är det oftast lättare att överföra maskar till en ny platta.
   • Med hjälp av dissektion omfattning, avgöra om varje mask är levande eller död.
   • Knacka försiktigt på plattan. Masken lever om det rör sig som svar på att knacka.
   • Om masken inte svarar trycka plattan, zooma in på huvudet regionen.
   • Knacka försiktigt på masken huvud med platina överföra plocka. Betyg masken som död om det inte svarar genom att flytta huvudet.
   • Döda maskar kan tas bort från plattan.
4. Anteckna datum och hur många maskar som lever och döda.
5. Återgå tallrikar till 20 ° C.
6. Upprepa steg 3,3 till 3,6 var 2 till 3 dagar tills alla maskar har dött.

Del 4: representativa resultat.

Den rådata som produceras av en nematod livslängd experiment är en lista över datum med motsvarande antal maskar som lever och död för varje testad stam. Antalet maskar som dör varje dag är normalt inverterad att beräkna andelen av maskar lever varje dag (Figur 2A), som ritas grafiskt som en överlevnad kurva (Figur 2B, dagen för den tidsinställda äggläggning anses dag 0 ). Livslängden för varje enskild mask i studien kan beräknas från räkningen av maskar som dör på varje dag och används för att beräkna medel-och medianvärdet livslängd för jämförelse mellan stammar. Greven av antalet maskar lever varje dag används inte direkt i livslängd analys. Worms upprätthålls på fasta medier kommer emellanåt att "fly", eller krypa uppåt väggen av plattan eller ner under media. Antalet maskar lever varje dag kan användas för att avgöra hur många maskar flydde under hela experimentet. Maskar som flyr vanligen bort från analysen. Som ett riktmärke, den typiska median livslängden för N2, C. elegans vildtyp stam, underhållas på UV dödade-bakterier vid 20 ° C är ca 25 dagar mätt från ägg.

Del 5: Lösningar

Figur 1. Ljusa fält bilder av C. elegans levnadsstadier, inklusive ägg, fyra larvstadier (L1 - L4), och vuxna. Alla paneler visar hermafroditer utom den nedre högra, som visar en vuxen man (Bild från Wood (1988)).

Figur 2. Representant resultat från ett C. elegans livslängd experimentera jämföra vilda N2 stammen till en stam med en mutation i DAF-2-genen. (A) En tabell som visar insamlade data, inklusive antalet dagar sedan maskar ägg, antalet döda maskar observeras på varje dag, och den procentandel av det ursprungliga provet kvar vid liv varje dag (beräknat från den dagliga räknas av döda maskar) . (B) överlevnadskurvorna som motsvarar de uppgifter livslängd ges i (A).

Figur 3. Representant jämförelse av lipofuscin mellan unga och gamla vuxna C. elegans. Ljusa fält bilder ska visas på vänster och DAPI kanal fluorescens bilder till höger. Krönskivor visar en 4 dagar gammal mask och paneler botten visar en 11 dagar gammal mask (mätt från ägg).

Den genetiska kontrollen av livslängden har studerats utförligt i C. elegans, mycket tack vare den lätthet och snabbhet med vilken livslängd kan fastställas. Protokollet diskuteras i denna artikel beskriver en grundläggande ram för att få reproducerbara uppgifter livslängd i C. elegans och kan även tillämpas på relatednematode arter. Genom att göra några enkla förändringar dessa förfaranden kan anpassas för att mäta livslängd under olika villkor ^2. Här kommer vi att diskutera flera vanliga varianter, inklusive levande bakterier, RNA-interferens (RNAi), dietrestriktioner av bakterier berövande, och drogfri NGM.

Förmodligen den mest vanlig variation från detta protokoll är att upprätthålla maskar på levande bakterier. Detta kan göras genom att göra ett antal mindre förändringar. Först, ändra förfarandet för sådd plattorna med bakterier (steg 1,7 till 1,13). Istället för att växa OP50 kulturer till mättnad, växa till mitten logga fas och pipett 200 mikroliter på tallrikar direkt från flytande kultur. Låt bakterier att växa upp på tallrikar över natten och utelämna exponering för UV. Ampicillin bör också undantas från plattorna med FUDR. En fördel med att använda levande bakterier är att maskar inte behöver överföras så ofta till nya plattor, eftersom bakteriell mat är levande och växer. Nackdelen levande bakteriella livsmedel är att OP50 är patogen för C. elegans. ³ Worms odlas på levande bakterier har en kortare lever span än maskar som odlas på UV dödade-bakterier, ³ som skulle kunna maskera fenotyper livslängd i samband med åldrande. Median livslängd på levande bakterier är cirka 20 dagar.

Gene riva av RNAi är lätt åstadkommas i C. elegans genom att ändra sin bakteriella mat så att den producerar dubbelsträngat RNA som motsvarar den gen som ska slås ner. Två RNAi bakteriella biblioteken är tillgängliga som täcker mer än 90% av den öppna läsning ramar i C. elegans arvsmassa. ^4-9 För att utnyttja RNAi i samband med livslängd, ersätter OP50 bakterierna med RNAi klon av intresse och följa de ändringar som diskuterats i föregående stycke för mätning av livslängden på levande bakterier. Det RNAi biblioteken använder en plasmid baserat uttryck system. Den plasmid är vald för att använda en Carbenicillin motstånd kassett och uttryck för dubbelsträngat RNA framkallas av isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Både Carbenicillin och IPTG behöver ingå i NGM plattorna. Ändra steg 1,4 genom att tillsätta 100 mikroliter 1 M IPTG och 50 mikroliter 50 mg / ml Carbenicillin per 100 ml NGM för båda typer av plattor. Ampicillin behöver inte läggas till antingen typ av skylt, eftersom Carbenicillin fyller samma funktion.

Dietrestriktioner är det mest studerade intervention för bromsa åldrandet över evolutionärt skilda arter. I C. elegans, maximal livslängd förlängning på fasta medier observeras när den bakteriella maten källan är helt bort i vuxen ålder, kallas en form av dietrestriktioner bakteriell deprivation (BD). ^{9, 10} För att mäta livslängd i samband med BD, gör två ändringar till ovanstående protokoll. Först förbereder en tredje typ av plåt. Dessa skyltar ska vara identiskt med Amp / FUDR plattor utom saknar den bakteriella näringskälla. För det andra, ändra del 3 att ta ett extra steg mellan steg 3,2 och steg 3,3. Den 4 dagen i vuxen ålder (4 dagar efter att överföra L4 att Amp / FUDR) överföring BD maskar att Amp / FUDR plattor saknas bakterier. En komplikation i samband med denna form av dietrestriktioner är maskar "tendens att fly. I avsaknad av mat maskarna inte kommer att bo nära centrum av plattan, men kommer att öka sitt område för prospektering efter mat. Som ett resultat kommer en större andel av maskarna krypa upp väggarna på plattan och uttorka. Vi ser ofta 50% till 70% av djuren flyr efter att ha förts till BD tallrikar. Att behandla denna fråga, börja med tre gånger så många maskar för att få ett betydande antal kvar på plattorna efter flygningen. BD kan också kombineras med levande bakteriella livsmedel utan ytterligare ändringar, eller med RNAi med en ytterligare modifiering. För BD med RNAi, måste en extra antibiotikum läggas på plattorna utan att bakterierna för att förhindra att bakterier överförs med maskar från att växa och ge en oönskad näringskälla. Två exempel är tetracyklin och kanamycin, antingen som kan läggas till FUDR plattorna utan bakteriell mat under steg 1,4. BD kan också inledas så tidigt som 2 dagar vuxen ålder eller så sent som 14 dagar vuxen ålder, utan någon betydande inverkan på livslängd. ¹⁰

Den sista ändringen att vi kommer att diskutera är att mäta livslängden på NGM tallrikar utan extra läkemedel (t.ex. ampicillin eller FUDR). Detta kan åstadkommasgenom att helt enkelt inte lägga till läkemedel till NGM under steg 4 och lägga till ett ytterligare steg i del 3. Utan FUDR maskarna kommer att fortsätta lägga ägg och producerar larv. Under deras reproduktiva fas (ca första veckan i vuxen ålder) alla experimentella maskar kommer att överföras till nya plattor var 2 dagar för att skilja dem från deras avkomma.

C. elegans är främst hermafroditer med sällsynta förekomsten av hanar. Livslängd är normalt mäts för hermafroditer bara, men kan också mätas för män. Det finns två utmaningar med att arbeta med manliga C. elegans. Den första är att skaffa en stor mängd manliga maskar, som hermafrodit självbefruktning ger en mycket liten del av manliga avkomma (0,1%). ¹¹ När en population som innehåller manligt maskar uppnås, producerar hane / hermafrodit parning ungefär lika många män och hermafroditer så länge maskar hålls i närvaro av föda. ¹² Kvinna lager kan beställas från Caenorhabditis Genetics Center eller genereras av visuellt screening för grundandet män framställs av hermafrodit självbefruktning. Den andra utmaningen är manligt sophantering beteende. I avsaknad av antingen mat eller potentiella kompisar (hermafroditer), hane maskar ange en sökning beteende läge som involverar ett brett utbud av rörelse. ¹³ när det underhålls på tallrikar detta beteende resulterar i en stor del av maskarna flyr upp plattan väggar och uttorkande . Den allmänna metod för att hantera denna svårighet är helt enkelt att börja med nog hanar att ett stort antal blivit kvar efter att de flesta har flytt.

Förutom livslängden, är en vanlig ålder-associerade fenotyp lipofuscin ackumulering. Lipofuscin är komplext cellulära avfall som inte kan brytas ned som byggs upp i celler med ålder och används som en biomarkör för åldrande i C. elegans. ^{14, 15} lipofuscin fluorescerar och kan enkelt visualiseras i C. elegans med DAPI kanalen i en fluorescensmikroskop (Figur 3). Lipofuscin ackumulering kan visualiseras i Worms är gjorde för livslängd direkt på NGM plattor, så samling en användbar sekundär fenotyp parallellt med livslängd.

Förutom livslängd, kan protokollet beskrivs i denna artikel också användas för att göra poäng fenotypisk progress av ålder-associerad förlamning i C. elegans modeller av proteotoxicity sjukdom. ¹⁶ När en mask blir förlamad det blir oförmögen att krypa över hela plattan, men kan ändå röra huvudet. En mask är protokollföras som förlamad om det inte går att flytta i förhållande till NGM som svar på plåt knacka eller petade med en platina överföring plocka, men inte röra huvudet. Maskar som dör vanligtvis behålla förlamning poäng (paralyserad eller inte förlamad) att de gavs under den senaste leva observation. Viktigt är även vild typ C. elegans blir förlamad med hög ålder. Av denna anledning förlamning är normalt inte poäng för maskar äldre än cirka 20 dagar, efter denna punkt blir det svårt att skilja mellan förlamning på grund av normalt åldrande och förlamning orsakas av progression av proteotoxicity sjukdomen.