The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Department of Molecular and Cell Biology, Harvard
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 23.22.252.150, User IP: 23.22.252.150, User IP Hex: 387382422
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).
Препараты:
Энуклеация
Манипуляции осуществляются с гидравлическим микроманипуляторами, (Narishige) на инвертированный микроскоп, такие как Nikon TE200. Микроманипулятора пьезо (Primetech) используется для бурения зона pellucida. Плоским наконечником энуклеации и передачи пипетки можно приобрести у Humagen. Очистите и смажьте энуклеации пипетки в ПВП капель, выслав микроскопические капельки ртути и аспирационных и исключение ПВП. Для предотвращения клейкости иглы, то же процедура должна быть выполнена между каждой группой ооцитов, которые либо энуклеированных или переданы.
Место небольшая группа ооцитов в HCZB-цитохалазином падение B. Размер группы должны быть адаптированы к уровню опыта исследователя. Ооцитов не должны храниться на сцене дольше, чем 20-30 мин. Перемещение инструментов HCZB-цитохалазин капель. Проведение пипетки и энуклеации пипетки должны быть приведены в соответствие с экваториальной плоскости яйцеклетки. Это станет возможным, если проведение пипетка имеет наружный диаметр, что немного меньше, чем яйцеклетки себя. Поворот яйцеклетки до разному преломления метафазы шпинделя могут быть видны. Если новичок не может видеть шпинделя, метафазной пластинки можно получить, используя ДНК красителя Hoechst и ультрафиолетовое освещение, однако, что не совместимо с эффективным эмбрионального развития. Позиция метафазы шпинделя в 3 часа и удерживайте ее хорошо с проведением пипетки. Применить пьезо импульсов проникнуть зона pellucida. Сенсорный метафазной пластинки с энуклеации пипетки. Как только сопротивление метафазы шпинделя может быть "чувствовал", аспирация шпинделя и вывести иглу. Цитоплазме ооцита является жидкостью, метафазы шпинделя однако движется как комок при прикосновении с пипеткой. Постарайтесь уменьшить количество цитоплазмы, который удаляется с шпинделя. После группы ооцитов была энуклеированных, мыть их через эмбрион культуральной среде и их размещение в инкубаторе до передачи. Некоторые энуклеированных ооцитов не должно быть передано, но должна быть активирована и служить в качестве контроля для энуклеации. Эти ооциты будет фрагмента в течение нескольких часов, что указывает на успешное энуклеации.
Ядерная передача
Место клеток в ПВП решение (11% ПВП в HCZB). Если многие клоны арест на 1-клеточной стадии, концентрации ПВП должен быть снижен до 5% или менее. Смешайте клетки и остроумиеч ПВП. Возьмите клеток с пипеткой с внутренним диаметром чуть меньше, чем диаметр клетки. Мембране клетки должно сломаться при аспирации. В некоторых случаях, повторяющиеся исключения и аспирации, а также применение нежные импульсы пьезо может быть использован для разрыва клетки-донора. Новая капля донорской клетки должны быть сделаны с каждой группы ооцитов, которые передаются, как донорских клеток становятся липкими через некоторое время. Inject сломанной донорских клеток вскоре после разрыва мембраны. Для передачи, сосредоточиться на экваториальной плоскости ооцитов себя, а не экваториальной плоскости зона pellucida, и положение передачу и проведение пипетки в одной плоскости. Держите ооцитов в том числе часть своей цитоплазмы твердо. Проникнуть зона pellucida использованием пьезоэлектрических импульсов. Принесите донора ядра до кончика пипетки, затем нажмите кончиком пипетки почти до противоположной стороны извлекли ядра яйцеклетки, близких к проведению пипетки, делая глубокие борозды в яйцеклетки. Аспирируйте очень небольшое количество цитоплазме ооцита в пипетку, нанесите один слабый пульс пьезо сломать ооцитов мембраны, извлечь донора ядра, извлеките иглу быстро, а аспирационных на цитоплазматические мембраны в правом конце борозды. При одновременном снятии иглой и аспирационных, она должна быть предусмотрена возможность закрытия отверстий, оставленных NT. Эта «дыра удаления техника позволит сократить количество яйцеклеток, что во время лизиса NT. Вымойте реконструированных яйцеклеток в KSOM и возвращения их в инкубатор на 1-3 часов.
Ооцитов активации
Подготовка половины блюдо с капельками кальция свободного MCZB, а другая половина с каплями кальция свободного MCZB плюс 10 мМ Sr 2 + и 5 μ г / мл цитохалазин ингибировать полярных экструзии тело. Равновесие в течение 30 мин. под 5% CO 2 в воздухе. Вымойте NT эмбрионы хорошо в бескальциевой MCZB, а затем поместить их в небольшие группы в различных капель бескальциевой MCZB. Вернуться блюдо инкубатора и культуры в течение 5-6 часов. Для контроля за искусственными протокол активации и для условий культивирования эмбрионов, не извлекли ядра ооцитов должны быть использованы. Они будут развиваться как партеногенетических эмбрионов. После активации, мыть эмбрионов путем KSOM и место эмбрионов в инкубаторе для долгосрочного культуры. Пронуклеусы должны быть видны в это время точки, указывая на успешную передачу.
Эмбрион Культурное Cookbook
Мастер Соли
Начните с 980 мл сверхчистой H 2 O в стерильных 1 л бутылка
Добавить сухие компоненты:
NaCl 4760 мг (81 мм) Sigma S-5886
KCl 360 мг (5 мм), Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 мг (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 мг (1.17mM) Sigma P-5655
ЭДТА 2NA 40 мг (0,1 мм) Sigma E-6635
Глюкоза (D) 1000 мг (5,5 мм) Sigma G-6152
Добавить жидкие компоненты
Na-лактата (молочной кислоты) 5,3 мл & NBSP; Сигма 44263
Pen'Strep 10 мл Gibco 15140-122
Для Соли MCZB складе:
Фильтры стерилизовать 500 мл мастер солей (хороший в течение 3-4 месяцев, хранить при 4 ° С)
Для Соли HCZB складе:
Начните с 500 мл соли мастера
Добавить 50 мг ПВА (холодный растворимый, Sigma P-8136)
Перемешать в течение 30-60 мин и стерильный фильтр (хорошо для 3-х месяцев, хранить при 4 ° С)
Са + + Бесплатный MCZB (для активации ооцитов в 5% CO 2)
Начните с 99 мл соли MCZB акции
Добавить сухие компоненты:
NaHCO 3 211 мг Sigma S-5761
Na-пирувата (пировиноградной кислоты) 3 мг Sigma P-4562
L-Глютамин 15 мг Sigma G-8540
Бычий сывороточный альбумин (BSA) 500 мг Сигма-3311
Swirl, пока все компоненты растворяются, стерильный фильтр.
HCZB (для микроманипуляция в окружающей атмосфере)
Начните с 99 мл соли HCZB акции
Добавить сухие компоненты:
Hepes-Na 520 мг Sigma H-3784
NaHCO 3 42 мг Sigma S-5761
Добавить жидких компонентов:
128 мМ CaCl 2 (18.8g / л) 1 мл Sigma C-7902
Отрегулируйте рН до 7,5 с 1 N HCl
Swirl до полного растворения, стерильный фильтр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Удачи!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
DE хотели бы поблагодарить д-ра Скрыть Akutsu для обмена его NT трюки и д-р Стивен Салливан и Гаррета Биркгофа для критических чтение протокола.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytochalastin B | Sigma-Aldrich | 100x stock = 500 ug/mL Cytochalasin B in DMSO. Store at -20˚ C. | |
| Strontium Chloride | 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature. | ||
| MCZB Stock Salts | Filter sterilize 500 mL master salts (good for 3-4 months; store at 4˚ C) | ||
| HCZB Stock Salts | Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4˚ C). | ||
| PVA | Sigma-Aldrich | P-8136 | cold-soluble |
| HCZB with 11% w/v PVP | Start with 20 ml HCZB medium in a 50 mL conical tube. Place 22g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4˚ C for 72 96 hrs, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4˚ C. | ||
| PVP | ICN Biomedicals | MW 360000 | |
| Please check for additional buffers compositions in the Protocol part. | |||
1. Eggan, K. & Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches (eds. Pease, S. & Lois, C.) (Springer, 2006).
2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K. & Behringer, R. Manipulating the mouse embryo (ed. Press, C. S. H. L.) (2003).
3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R. & Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-74 (1998).
I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!
1
ReplyPosted by: Abdollah Mohammadi SangcheshmehMay 5, 2008, 8:07 AM