Часть 1: Настройка инфекции

1. Расти HeLa клеток в колбах и ждать, пока клетки приблизительно на 80% вырожденная.
2. Подготовка достаточно вирусных питательную среду для эксперимента: регулярные DMEM с 2% ЭТС и без добавления антибиотиков.
3. Инфекция может быть выполнена либо с сырой запасов вируса коровьей оспы с известным титром, или сахароза очищенный вирус с известным титром, если вы беспокоитесь о хост экспрессии генов.
4. Если вы используете сахарозы очищенный вирус, переходите к части 2.
5. Если вы используете сырой вируса коровьей оспы акций, непосредственно перед инфекцией, разрушать ультразвуком аликвоты вируса в чашку sonicator с ванной в основном из льда и небольшого количества воды.
   • Разрушать ультразвуком около 30 Вт в течение 20 секунд.
   • Вихревые трубки и повторить обработку ультразвуком в 3 раза, добавляя больше льда, если это необходимо держать чашку упакован со льдом и охлажденным.
   • Vortex между каждым шагом обработки ультразвуком.
   • Приступить к части 2.
6. Или же, если вы не обладаете чашку sonicator, смешать равные объемы сырой запас вируса и 0.25mg/mL трипсина.
   • Vortex энергично.
   • Инкубируйте вирус запасов / трипсин смеси в 37 ° С водяной бане в течение 30 минут.
   • Vortex на 5-10 минутным интервалом.
   • Приступить к части 2.

Часть 2: Заражение клетки

1. Рассчитать количество вирусных частиц необходимо, чтобы заразить монослоя на желаемом множественности заражения (МВД). Как правило, высокие МВД (между 5 и 10) используется для инфекции timecourses.
2. Добавить необходимое количество сахарозы очищенный вирус или вирус трипсином сырой до 37 ° C вирусных питательной среды и хорошо перемешать. Вы должны использовать достаточно средств массовой информации, чтобы только покрыть дно колбы. Например, 10 мл среды для Т-175 колбу.
3. Удаление информации из ячеек и промойте комнатной температуре PBS.
4. Добавить вирус / вирусный питательной среды для каждой колбе.
   • Swirl мягко, наклона пластин и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО2-инкубатора в течение 1 часа.
   • Наклон и вихревые пластин каждые 15 минут распространение вируса равномерно и сохранить клетки влажным.
   • Для момента времени 0hr/Mock, добавить вирусные медиа роста только, без каких-либо вирус, добавленный.
5. После 1 часа инкубации удалить средах, содержащих вирус, и полоскать в три раза при комнатной температуре PBS.
6. Добавить максимальное количество вирусных питательную среду для каждого флакона. Например, 30 мл среды для Т-175 колбу. Начало подсчета этом качестве точки 0 раз в час.

Часть 3: Уборочная клетки

1. Проверьте клетки под микроскопом и отметить любые цитопатический эффект (ЦПЭ).
2. Выньте материал и промойте клетки с 30 мл комнатной температуре PBS.
3. Добавьте 15 мл трипсина в клетки и инкубировать в течение 2-5мин при температуре 37 ° C.
4. Проверьте под микроскоп для мобильного отряда и нажмите колбе осторожно, чтобы выбить клеток.
5. Передача клеток с стерильных серологические пипетки в 50 мл коническую трубку.
6. Промыть колбу с равным объемом средств массовой информации роста клеток, а также добавлять СМИ трипсинизировали клеток в конической трубе.
7. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
8. Удалить трипсина / СМИ от осадок клеток.
9. Ресуспендируют осадок клеток в любом TRIzol реагента или лизис буфера от желаемого комплект изоляции РНК.
10. Если вы используете TRIzol, разделить образца в 1 мл аликвоты в 1,5 мл меченых труб Эппендорф и заморозить при -80 ° C.
11. Повторите эти действия для всех временных точках, сбор урожая в одном флаконе момент времени.

Часть 4: РНК добыча образцов в TRIzol

1. На данный момент, ваши образцы должны быть ресуспендировали в TRIzol реагента и готовы к обработке.
2. Добавить 200 мкл реагента Разделение фаз BCP на каждый 1 мл TRIzol в каждой трубке. Возможно, вам придется перенести образец больше трубку, если вы начинаете с большим количеством TRIzol.
3. Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
4. Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут.
5. Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху. Вы должны быть в восстановление примерно 600μL на каждый 1 мл TRIzol вы начали с.
6. У второго фенол / хлороформ добычи, на этот раз используя 500 мкл хлороформа на 1 мл TRIzol, вместо того, BCP.
7. Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
8. Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут.
9. Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху.
10. Добавить 20 мкг линейных акриламида для каждого образца. Линейные акриламида выступает в качестве носителя и помогает осадок РНК.
11. Добавить 500-миCRO, L изопропанола на 1 мл TRIzol вы начали с для каждого образца и хорошо перемешать.
12. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут.
13. Центрифуга в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 10-15 минут.
14. РНК гранулы будут видны в нижней части трубы. Очень осторожно, удалить супернатант из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Не беспокоить гранул.
15. Вымойте гранул с 1 мл 70% этанола.
    • Добавить 1 мл 70% этанола, пеллет.
    • Центрифуга с максимальной скоростью 14 000 г в течение 5-7 минут.
    • Очень осторожно, удалить этанола из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Убедитесь, что гранулы видна в нижней части трубы.
    • Удалите супернатант.
16. Повторите мыть шаг. После надосадочную отбрасывается, отметить, где осадок на трубке.
17. Воздух сухой шарик на срок не более 5 минут. Не пересушивать или РНК будет трудно восстановить!
18. Если вы хотите следовать необязательный лечения ДНКазы для удаления остатков ДНК из образца, ресуспендируют осадок в 17μL нуклеазы без воды. В противном случае, ресуспендируют осадок в 20 мкл нуклеазы без воды и перейдите к шагу 22.
19. (Дополнительно лечение ДНКазы) Использование Qiagen РНКазы без ДНКазы установлен, добавить 2μL буфера RDD и 1 мкл РНКазы восстановленный без ДНКазы я к ресуспендировали РНК. Осторожно перемешать.
20. (Дополнительно лечение ДНКазы) Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут.
21. (Дополнительно лечение ДНКазы) Добавить 2μL в 2,5 мМ ЭДТА и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 5 минут для инактивации ДНКазы. Не превышайте время инактивации или температуры как раз больше / более высоких температурах может привести к деградации РНК.
22. Проверьте концентрацию РНК спектрофотометр.
23. Храните образцы РНК при температуре -80 ° C.
24. (Дополнительно КК) Проверьте качество РНК с использованием Agilent BioAnalyzer, или путем запуска образца на денатурирующих гель и проверки OD чтениях. (260nm и 260/280 отношение)

Критические Шаги

Часть 1 и 2

Есть несколько важных шагов для создания синхронной инфекции вакцины, первая из которых осторожны ультразвуком (или trypzinizing) вируса, чтобы разбить вирусных частиц. Vaccinia очень склонны к агрегирования, и нарушение вирусных частиц имеет важное значение для обеспечения даже заражение клеток. Для того чтобы добиться синхронного инфекции, высокая МВД (больше 2) должна быть использована для обеспечения каждой клетки инфицированы. Смесь зараженных и незараженных клеток приведет к несколько раундов инфекции, гетерогенные смеси временных точек, и асинхронных вирусных и принимающих транскрипционных ответов. Инфекции должна осуществляться в минимальном количестве средств массовой информации для обеспечения максимальной адсорбции вируса на клетки. Кроме того, регулярное встряхивания колб или культуры блюд (каждые 10 минут) дает распределение вируса через колбу и гарантирует, что клетки не высыхают.

Часть 4

1-бром-3-хлорпропан (BCP) используется вместо фенола уменьшить загрязнение геномной ДНК. Последующего дополнительного лечения ДНКазы (Qiagen РНКазой свободной ДНКазы), также могут быть выполнены, чтобы устранить любые остающиеся геномной ДНК. Второй экстракции хлороформом используется, чтобы удалить все следы органического растворителя из добычи, так как даже следовых количествах может подавлять последующие шаги усиления. Следы фенол / BCP могут быть обнаружены как шип на 270nm (помимо стандартных пик при 260nm) при измерении поглощения от общего числа РНК после экстракции. Если такое загрязнение кажется, повторно извлекать РНК (с помощью фильтров или столбца основе РНК метод извлечения), прежде чем приступить к усилению. Минимальное количество РНК, необходимой для выполнения усиления реакции 100ng, однако 500-1000ng является предпочтительным.

Применение / Значение

Меченой РНК в результате такой протокол может быть гибридизированных к человеку, вирусные, или пользовательские микрочипы, чтобы оценить реакцию экспрессии генов в инфицированных клетках в культуре. Microarray платформах меняются, поэтому следуйте инструкции производителя для приготовления смеси из гибридизации меченого зонда.

Использование специально созданных poxvirus массив ^1, мы смогли классифицировать гены в общие категории "рано" или "поздно", основанный на сроках гибридизации сигнала и действительно ли вирусной репликации ДНК, необходимые для стенограммы обнаружения. Мы наблюдали ожидается функциональных категорий генов в каждой временной класса (то есть, ожидается в начале, промежуточных и поздних генов) изменения, чтобы точные сроки транскрипции.

Методы, используемые в этой работе, в состоянии предсказать транскрипции генов вируса рано или поздно в цикл репликации, но труднее отличительной раннего только против генов с ранней и поздней промоутер с стенограммы с двойным раннего / позднего промотора может сохраняться и быть обнаружено на поздних временах. Кроме того, прогон транскрипции поздних вирусных генов могут влиять на сигнал в данный зонд / пятна на линейке, а РНК-гибридизации с массивом может исходить из назначенных ORF или вверх по течению ORF. Черепица массивы пытались решить эту проблему, однако проблемы остаются в обнаружении пробегать транскрипции использованием гибридизации подходов ^2,3,4.

Хост транскрипционной модели также может быть оценена с помощью этих методов. Тем не менее, вакцины кодирует различные механизмы для подавления хоста ответов, и принимающих транскрипционный ответ может быть уменьшена по сравнению с другими стимулами ^5,6,7,8. Так как выражение многих генов, участвующих в защите организма меняется после заражения, вклад вирусных генов, которые противодействуют иммунного ответа должны быть приняты во внимание.

Используя эти методы, карта транскрипционной сроки все вирусные гены могут быть выявлены и использованы для допроса функций от неизвестных вирусных генов. Кроме того, эти методы могут быть использованы, чтобы вскрыть сложные диалога между вирусом и хозяином. Эти методы широко применимы для других хост-системами возбудителя инфекции. Если возбудитель интереса не указал полиаденилированной мРНК, альтернативные методы могут быть использованы непосредственно этикетке общей РНК, без линейного усиления. Анализируя хозяина и выражение гена вируса во время синхронного инфекции, эти методы позволяют получить представление о взаимодействии вируса с принимающей клеточного окружения, а также принимающих против защиты от вирусной инфекции.