Deel 1: Het opzetten van de infectie

1. Groeien HeLa cellen in flesjes en wacht tot de cellen zijn ongeveer 80% confluent.
2. Bereid voldoende virale groei medium voor het experiment: regelmatig DMEM met 2% FBS en geen toegevoegde antibiotica.
3. De infectie kan worden uitgevoerd met ofwel een ruwe voorraad van vaccinia virus met een bekende titer, of sucrose gezuiverd virus met een bekende titer als u zich zorgen over de verhuurder genexpressie.
4. Als u gebruik maakt van sucrose gezuiverd virus, meteen doorlopen naar deel 2.
5. Als u gebruik maakt van een ruwe vaccinia virus voorraad, net voor de infectie, ultrasone trillingen een hoeveelheid van het virus in een beker ultrasoonapparaat met een bad van voornamelijk ijs en een beetje water.
   • Ultrasone trillingen rond de 30W gedurende 20 seconden.
   • Vortex de buis en herhaal de sonicatie 3 keer, het toevoegen van meer ijs als dat nodig is om de beker vol met ijs en gekoeld te houden.
   • Vortex tussen elke ultrasoonapparaat stap.
   • Ga verder naar deel 2.
6. Als alternatief, als je niet een kopje ultrasoonapparaat bezitten, meng een gelijk volume van de ruwe virus voorraad en 0.25mg/mL trypsine.
   • Vortex krachtig.
   • Incubeer het virus voorraad / trypsine mix in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten.
   • Vortex op 5-10 minuten.
   • Ga verder naar deel 2.

Deel 2: infecteren cellen

1. Bereken de hoeveelheid virale deeltjes die nodig zijn om de monolaag te infecteren op de gewenste multipliciteit van infectie (MOI). Doorgaans wordt een hoge MOI (tussen 5 en 10) die worden gebruikt voor infectie timecourses.
2. Voeg de gewenste hoeveelheid sucrose gezuiverde virus of getrypsiniseerd ruwe virus tot 37 ° C virale groei media en meng goed. U moet gebruik maken genoeg media om alleen betrekking hebben op de bodem van de kolf. Bijvoorbeeld, 10 ml van media voor een T-175 kolf.
3. Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen en spoel af met kamertemperatuur PBS.
4. Voeg de virus / virale groei media aan elke kolf.
   • Roer voorzichtig, tilt platen en incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 1 uur.
   • Kantelen en swirl platen om de 15 minuten gelijkmatig verspreiden virus en houden cellen vochtig.
   • Voor een 0hr/Mock tijdstip, alleen maar de virale groei van media, met geen virus toegevoegd.
5. Na 1 uur incubatie, verwijder de media die het virus, en spoel drie keer met PBS kamertemperatuur.
6. Voeg de maximale hoeveelheid van virale groeimedium aan elke kolf. Bijvoorbeeld, 30 ml van media voor een T-175 kolf. Beginnen te tellen dit als je 0 uur tijdstip.

Deel 3: Oogsten van cellen

1. Controleer of de cellen onder een microscoop en noteer eventuele cytopathogeen effect (CPE).
2. Verwijder de media en spoel cellen met 30 ml van de ruimtetemperatuur PBS.
3. Voeg 15 ml trypsine aan de cellen en incubeer 2-5 min bij 37 ° C.
4. Controleer onder de microscoop voor mobiele onthechting en tik kolf cellen los te maken.
5. Transfer cellen met een steriele pipet serologisch in een 50 ml conische buis.
6. Was de kolf met een gelijk volume van de celgroei media, en voeg de media om de getrypsiniseerd cellen in de conische buis.
7. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Verwijder het trypsine / media uit de cel pellet.
9. Resuspendeer de celpellet in een van beide TRIzol reagens of de lysis buffer van uw gewenste RNA isolatie kit.
10. Als u gebruik maakt TRIzol, het monster te verdelen in 1 ml monsters in 1,5 ml label Eppendorf buizen en vriezen bij -80 ° C.
11. Herhaal dit voor alle tijden punten, de oogst een fles per tijdstip.

Deel 4: RNA-extractie van de monsters in TRIzol

1. Op dit punt, moet je monsters te worden gesuspendeerd in TRIzol reagens en klaar om te worden verwerkt.
2. Voeg 200μL van het BCP fasescheiding Reagens voor elke 1 ml TRIzol in elke buis. Het kan nodig zijn om het monster over te dragen aan een grotere tube als je begint met een grote hoeveelheid TRIzol.
3. Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
4. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten.
5. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant. U moet herstellen van ongeveer 600μL voor elk 1 ml van TRIzol je uit begonnen.
6. Doe een seconde fenol / chloroform extractie, dit keer met 500μL van chloroform per 1 ml TRIzol, in plaats van BCP.
7. Vortex of schud krachtig en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
8. Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 15 minuten.
9. Breng de waterige fase naar een nieuwe buis. De waterige fase is de heldere laag aan de bovenkant.
10. Voeg 20 microgram acrylamide lineaire aan elk monster. De lineaire acrylamide fungeert als een drager en helpt bij het neerslaan van de RNA.
11. Voeg 500 & micro, L van isopropanol per 1 ml TRIzol je begonnen met aan elk monster en meng goed.
12. Incubeer monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
13. Centrifuge in een microcentrifuge op maximale snelheid gedurende 10-15 minuten.
14. Het RNA pellet zullen zichtbaar zijn op de bodem van de buis. Heel voorzichtig, verwijder het supernatans van de buis, hetzij met een stofzuiger aspirator, of handmatig door pipet. Niet verstoren van de pellet.
15. Was de pellet met 1 ml 70% ethanol.
    • Voeg 1 ml 70% ethanol aan de pellet.
    • Centrifugeer op topsnelheid 14.000 g gedurende 5-7 minuten.
    • Heel voorzichtig, verwijder de ethanol uit de buis, hetzij met een vacuüm aspirator, of handmatig door pipet. Controleer of de pellet zichtbaar is op de bodem van de buis.
    • Giet het supernatans af.
16. Herhaal de wasstap. Nadat het supernatans verwijderd, markeren waar pellet is op de buis.
17. Drogen aan de lucht pellet niet langer dan 5 minuten. Niet Kreukherstellend, of het RNA zal moeilijk zijn te reconstrueren!
18. Als u de optionele DNase behandeling te volgen om alle resterende DNA uit het monster, resuspendeer de pellet in 17μL van nuclease-vrij water. Anders, resuspendeer de pellet in 20μL van nuclease-vrij water en ga naar stap 22.
19. (Optioneel DNase behandeling) Met behulp van de Qiagen RNase-vrij DNase set toe te voegen 2μL Buffer RDD en 1μL gereconstitueerd RNase-vrij DNase I tot en met de geresuspendeerde RNA. Meng voorzichtig.
20. (Optioneel DNase behandeling) Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
21. (Optioneel DNase behandeling) 2μL van 2,5 mM EDTA en incubeer Voeg bij 65 ° C gedurende 5 minuten om de DNase inactiveren. Niet hoger zijn dan de inactivatie tijd of temperatuur als langere tijd / hogere temperaturen kan afbraak van het RNA oorzaak.
22. Controleer de RNA-concentratie door de spectrofotometer.
23. Bewaar het RNA-monster bij -80 ° C.
24. (Optioneel QC) Controleer de kwaliteit van RNA met behulp van een Agilent BioAnalyzer, of door het uitvoeren van het monster op een denaturerende gel en het controleren van de OD lezingen. (260nm en 260/280 ratio)

Kritische stappen

Deel 1 & 2

Er zijn verschillende kritische stappen om het opzetten van een synchrone vaccinia infectie, waarvan de eerste voorzichtig sonicatie (of trypzinizing) van het virus, om virusdeeltjes splitsen. Vaccinia is zeer gevoelig voor het aggregeren, en de verstoring van het virus deeltjes is belangrijk voor het waarborgen van zelfs infectie van cellen. Met het oog op een synchrone infectie te bereiken, moet een hoog MOI (groter dan 2) worden gebruikt om ervoor te zorgen elke cel is geïnfecteerd. Een mengsel van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen zal leiden tot meerdere ronden van infectie, heterogene mengsels van tijdstippen, en asynchrone virale en gastheer transcriptionele reacties. De infectie dient te worden uitgevoerd in minimale hoeveelheden van de media om een ​​maximale adsorptie van het virus toe op de cellen. Daarnaast, regelmatig schudden van de kolven of de cultuur gerechten (elke 10 minuten) kan de verdeling van het virus over de kolf en zorgt ervoor dat de cellen niet uitdrogen.

Deel 4

1-broom-3-chloorpropaan (BCP) wordt gebruikt in plaats van fenol om genomisch DNA besmetting te verminderen. Een volgende optie DNAse behandeling (Qiagen RNAase Free-DNAse) kan ook worden uitgevoerd om eventuele resterende genomisch DNA te elimineren. Een tweede chloroform extractie wordt gebruikt om alle sporen van organisch oplosmiddel te verwijderen uit de winning, aangezien zelfs kleine hoeveelheden kunnen remmen daaropvolgende amplificatie stappen. Sporen van fenol / BCP kan worden gedetecteerd als een piek op 270nm (ook buiten de standaard piek op 260nm) bij het meten van absorptie van totaal RNA na extractie. Indien een dergelijke besmetting verschijnt, re-extract het RNA (met behulp van een filter of kolom op basis van RNA-extractie-methode) alvorens tot versterking. Minimale hoeveelheid RNA die nodig is om het uitvoeren van een amplificatiereactie 100ng is, maar 500-1000ng heeft de voorkeur.

Toepassing / Betekenis

De gelabelde RNA als gevolg van dit protocol kan worden gehybridiseerd met mens, virale, of aangepaste microarrays om genexpressie reacties te beoordelen geïnfecteerde cellen in cultuur. Microarray platforms variëren, dus volg instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van hybridisatie mengsel uit gelabelde probe.

Met behulp van een speciaal ontworpen pokkenvirus matrix ^1, waren we in staat om genen in te delen in de algemene categorieën van "vroege" of "te laat", gebaseerd op de timing van hybridisatie-signaal en het al dan niet virale DNA-replicatie nodig was voor transcriptie detectie. We zagen de verwachte functionele categorieën van genen in elke tijdelijke klasse (dat wil zeggen, de verwachte vroege, intermediaire en late genen) variatie met betrekking tot de precieze timing van de transcriptie.

De methoden gebruikt in dit werk zijn in staat om virus genen vroeg of laat in de replicatiecyclus overgeschreven te voorspellen, maar hebben meer moeite te onderscheiden vroeg alleen-versus genen met een vroege en late promotor sinds transcripten met een dubbele vroege / late promotor kan blijven bestaan ​​en worden gedetecteerd op late tijden. Daarbij mag run-through transcriptie van late virale genen van invloed op het signaal op een gegeven probe / plek op de matrix, zoals de RNA hybridiseren aan de array kan afkomstig zijn van de aangewezen ORF of een upstream ORF. Tiling arrays hebben geprobeerd dit probleem op te lossen, maar uitdagingen blijven bij het ​​opsporen van lopen door transcriptie met behulp van hybridisatie gebaseerde benaderingen ^2,3,4.

Host transcriptionele patronen kunnen ook worden beoordeeld met behulp van deze methoden. Echter, vaccinia codeert voor een verscheidenheid van mechanismen om te remmen gastheer reacties, en host transcriptionele respons kan verminderd zijn ten opzichte van andere stimuli ^5,6,7,8. Sinds de expressie van vele genen betrokken bij de afweer is veranderd na de infectie, moet de bijdrage van virale genen die host immuunreacties tegen te gaan dan ook rekening worden gehouden.

Gebruik makend van deze methoden kan een kaart van de transcriptionele timing van alle virale genen worden geïdentificeerd en gebruikt om de functies van onbekende virale genen te ondervragen. Daarnaast kunnen deze methoden worden gebruikt om de ingewikkelde dialoog tussen virus en gastheer ontleden. Deze methoden zijn over het algemeen van toepassing op andere gastheer-pathogeen infectie systemen. Als de ziekteverwekker van belang geen gepolyadenyleerde mRNA's, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om direct het etiket van de totaal RNA, zonder lineaire versterking. Door het analyseren van zowel de gastheer en virus genexpressie tijdens de synchrone infectie, deze methoden stellen ons in staat inzicht te krijgen in virus interactie met de gastheer cellulaire omgeving als gastheer contra-afweer tegen virusinfecties.