والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

خلية التحضير :

1. قبل البذر الخلية العصبية للمقايسة والثقافة ، و/ النجمية النمو في وسائل الإعلام حتى ~ متموجة 70-80 ٪ (ما لم تكن الخلية البذر مباشرة من الذوبان أو العزلة).
2. فصل الخلايا من قوارير ثقافة / لوحات عن طريق الأسلوب المناسب لنوع من الخلايا في المصالح. إذا لزم الأمر ، وحفر الآبار لوحة معطف مقايسة مع بروتين المصفوفة بولي - D - يسين أو خارج الخلية لتعزيز التصاق الخلية. قد يكون المصنف المشترك ثقافات النجمية والخلايا العصبية في نفس الوقت أو بالتتابع. تصنيف المنتخبات لمتسلسلة ، فمن المستحسن تصفيح النجمية أولا بوصفها طبقة "القاعدية" ، تليها الطلاء وتمايز الخلايا العصبية ، إذا لزم الأمر. ضبط كثافة الخلايا بما يتناسب مع نوع من الخلايا ، بعد وقت والثقافة ، والمعلمات في المصالح ، وما إلى ذلك اعتمادا على العمر والثقافة ، ومصدر الخلية وكثافة الغرس والثقافات الأولية قد تختلف اختلافا كبيرا في معدل الانتشار ، GFAP التعبير أو ثمرة neurite -- من المهم أن توصيف وتحسين النظام الخاص خلية لتوفير أكثر ملاءمة البيولوجية للنموذج التجريبي الخاص ، وكذلك لتوفير التصوير فعالة ، وتجزئة والتحليل باستخدام HCS (انظر الشكل 1). بعد إضافة الخلايا لوحة (قد تكون خلايا المصنف في 90 ميكرولتر وسائل الاعلام ، لتسهيل معالجة السم كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه) ، والسماح لوحة على الجلوس على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة ل15-30 دقيقة ، مما يتيح توزيع الخلية حتى. بعد هذه الفترة ، واحتضان خلايا النمو في وسائل الإعلام (37 ° / C 5 ٪ CO ₂₎ ما لا يقل عن 24 ساعة ، ثم التبديل إلى ظروف ثقافة التمايز (على سبيل المثال ، المصل منخفض / NGF PC12 للخلايا) ، حسب الاقتضاء. تواصل الثقافة حتى تصل إلى مستوى الخلايا المطلوب من التقاء أو التمايز ، وتغيير وسائل الاعلام على فترات مناسبة لنوع من الخلايا.
3. ويمكن إدخال علاجات الخلية (مركبات السيطرة ، اختبار المركبات ، الخ) في أي وقت خلال هذه الفترة والثقافة ، وبما يتناسب بالطبع وقت للعلاج من الفائدة. يتم توفير مادة الأكريلاميد ، بيروكسيد الهيدروجين وK - 252a ومركبات التحكم العصبي. يتم توفير الكواشف كافية لمكررة من 12 نقطة منحنيات الاستجابة للجرعة (بما في ذلك O ₂ درهم أو مجموعة DMSO التحكم في الاستجابة للجرعة) لجميع لوحات five 96 - جيدا. يتم توفير هذه المركبات في تركيز 250X (K - 252a ل، على افتراض علاج أقصى 1 ميكرومتر) أو 10X (على مادة الأكريلاميد وبيروكسيد الهيدروجين ، على افتراض العلاجات أقصى 100 ملم و 10 ملم على التوالي). أوصى بإعداد العلاج ينطوي نصف السجل (1 : √ 10) التخفيف المتسلسل للمجمع في DMSO 250X ، تليها في تخفيف مؤقت لمجمع التخفيف 10X (يمكن السيطرة المركبات 10X منشؤها درهم ₂ O المخفف متسلسل مباشرة في العقيمة O ₂ درهم أو التخفيف مجمع العازلة). قد ثم 10 ميكرولتر من كل معاملة يمكن ان تضاف الى وسائل الاعلام ميكرولتر 90 من ثقافة موجودة بالفعل في كل بئر ، على التركيز إلى 1X النهائي (0.4 ٪ أو 10 ٪ DMSO درهم ₂ O). يتم توفير نموذج البيانات لمدة 24 أو 96 ساعة من العلاج المركب عند 37 درجة مئوية قبل التثبيت.

التثبيت الخلية ويلطخ مناعي :

ملاحظة : الوقت هو تلطيخ ~ 2.5 ساعة بعد التثبيت. لا تسمح لتجف الآبار بين الخطوات تلطيخ. وينبغي إجراء الطموح والإعفاء من الكواشف في معدلات التدفق المنخفض لتقليل أي خسارة الخلايا نتيجة القص السوائل. وأوصت جميع 'لكل بئر" الرجوع إلى مجلدات واحد جيد لmicroplate 96 - جيدا. وأوصت جميع 'في 96 - جيدا لوحة" تشمل كميات الزائدة بنسبة 25 ٪ لمعالجة فقدان السوائل وحدة التخزين. يتم تنفيذ جميع الخطوات تلطيخ في درجة حرارة الغرفة (RT). جميع مخازن والحلول الضد مستقرة لمدة لا تقل عن 24 ساعة في RT.

4. في نهاية الفترة والثقافة ، وقبل حلول الحارة التثبيت HCS (2X) إلى درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية إذا كان المطلوب (12 mL/96-well لوحة). في غطاء الدخان الكيميائية ، إضافة 100 ميكرولتر / إضافة إلى وسائل الإعلام بشكل مباشر والثقافة ، وتسمح لإصلاح لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة تثبيتي / توكسين التي تحتوي على وسائل الاعلام والتصرف فيها بما يتفق مع لوائح للنفايات الخطرة (أنظر MSDS). إذا كان الشروع فورا في تلطيخ ، وشطف كل بئر مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي المناعي HCS. بدلا من ذلك ، إذا أن تكون لوحات ملطخة في وقت لاحق ، وشطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل ، ثم ترك اشطفها ثانية وحدة التخزين في الآبار وألواح تخزين مغلقة بإحكام عند 4 درجات مئوية حتى تلطيخ.
5. إذا تم تخزين عينات ثابتة عند 4 درجات مئوية قبل التلوين ، وشطف مرتين مع 200 مخزن HCS ميكرولتر المناعي قبل المضي قدما في بروتوكول تلطيخ.
6. إعداد العاملين حل المضادة للأرنب βIII تويولين / ماوس HCS أجسام المضادة للGFAP الابتدائية (6 mL/96-well وحة) على النحو التالي : إضافة 60 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الأولية لإذابة 5.88 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد. إزالة الاحتياطي المناعي السابقة الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من محلول جسم الابتدائية إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
7. إزالة جسم الابتدائيةالحل. شطف ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS.
8. يعد حل عمل جسم HCS الثانوي / هويشت HCS النووية اللطخة (لوحة mL/96-well 6) على النحو التالي : إضافة 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة الثانوية إذابة و 30 ميكرولتر من إذابة النووية HCS هويشت اللطخة إلى 5.91 مل من الاحتياطي المناعي HCS. مزيج جيد ، وحماية الحل بعيدا عن الضوء. إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. إضافة 50 ميكرولتر من جسم HCS الثانوي / هويشت HCS حل اللطخة النووية واحتضان لمدة 1 ساعة على RT ، محمية من الضوء.
9. إزالة HCS الثانوية جسم / هويشت HCS حل اللطخة النووية. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر الاحتياطي المناعي HCS.
10. إزالة السابقة الاحتياطي المناعي HCS الشطف. شطف مرتين مع 200 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل HCS ، تاركا اشطفها ثانية الحجم في الآبار.
11. ختم لوحة وصورة مباشرة ، أو متجر لوحة عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى جاهزة للتصوير.

الحصول على الصور والتحليل :

12. ويمكن تنفيذ التصوير والتحليل لوحات ملطخة على مجموعة متنوعة من المنصات HCS المتاحة ، بما في محلل الخلية (GE للرعاية الصحية) ، ArrayScan (ThermoFisher العلمية) أو الأوبرا (بيركن إلمر). وتقدم بعض المبادئ التوجيهية لالتصوير والتحليل في الجدول رقم 1 :

. الجدول 1 صورة اقتناء وتحليل المبادئ التوجيهية -- HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (المشارك للثقافة) الفحص

ممثل النتائج :

الشكل 1. βIII - تويولين وimmunofluore GFAPscence الثقافات الخلية العصبية الفئران مختلطة.

وقد تم توليد المشترك ثقافات النجمية الفئران الحصين الابتدائية إما مع الخلايا العصبية الفئران أو الجرذان الأولية الحصين الخلايا PC12 ما قبل طلاء الخلايا النجمية لعدة أيام في الثقافة ، تليها بذر العصبية. وكانت الخلايا العصبية مثقف الأولية ل11 يوما إضافية ، بينما المثقف PC12s ليوم 2 إضافية في ظل ظروف التمايز (المصل منخفض / NGF). أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (الخلايا العصبية الأولية) ، أو 10X التكبير الهدف (PC12) وتحليلها باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل لوحة الهدف الأعلى : صور تنصهر HCS هويشت مضان (الحمراء) النووية اللطخة (الأزرق) ، βIII - تويولين (الخضراء) وGFAP. تحليل منفصل للقناة مضان βIII - تويولين يسمح للتجزئة ثمرة neurite (لوحة الأوسط : أجسام الخلايا العصبية المحددة في (الزرقاء الأولية) ، أو الصفراء (PC12) ، neurites باللون الأخضر (الخلايا العصبية الأولية) ، أو الأزرق الفاتح (PC12)). تحليل للقناة GFAP يسمح للتجزئة نجمية (اللوحة السفلية : نوى المبينة باللون الأزرق ، السيتوبلازم باللون الأخضر). GFAP تجزئة للقرن آمون الفئران الخلايا العصبية الأولية / نجمية الثقافة المشتركة يدل على القدرة على التمييز بين النوى / خلية الهيئات التي GFAP (+) (الخطوط الخضراء) وتلك التي GFAP (--) (الحمراء) ، مما يمكن تعداد خلايا منفصلة الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وضع ثقافة مختلطة.



الشكل 2. الردود الأولية الفئران جرعة من الخلايا العصبية الحصين / نجمية المشترك الثقافات لتؤكد السامة.

وكانت مطلية النجمية الجرذان الأولية الحصين (P6) على لوحات - 96 بشكل جيد في وسائط النمو والمثقف لمدة 6 أيام. وكانت المصنفة ثم الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الأولية (المباشرة من ذوبان الجليد) على رأس قبل مطلي النجمية والمثقف في وسائل الإعلام النمو لمدة 11 يوما. تم علاج الخلايا مع التخفيفات المتسلسلة لبيروكسيد الهيدروجين أو الأكريلاميد (تركيزات بحد أقصى = و100mM 10MM ، على التوالي) عن ال 24 ساعة الماضية للثقافة. أجريت معالجة الخلايا ، وتثبيت immunostaining وفقا لبروتوكولات مقايسة HCS222. وكان تصوير الخلايا على شركة جنرال الكتريك في محلل خلية 1000 (3.3) في 20X (10 الحقول / جيد) وتحليلها (النووية / هيولي / neurite تجزئة) باستخدام GE في محطة خلية 1000 محلل (3.4) وثمرة Neurite موضوع خوارزميات تحليل الهدف. البيانات المقدمة ويعني ± SEM ، ن = 3. وقد تم التحقيق معلمات متعددة (ثمرة neurite ، وكثافة GFAP ، منطقة نجمية وعدد الخلايا العصبية أو نجمي) للجرعة التي تعتمد على الاتجاهات.

حتى الآن ، في التجارب المختبرية تهدف إلى دراسة وتقييم المخاطر العصبية باستخدام ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية كانت محدودة. فمن المعروف جيدا أن الخلايا الدبقية المقبولة هي جزء لا يتجزأ في تقديم الدعم المكاني والتمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وتلعب دورا حاسما في وظائف عدة تحوير الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية بما في ذلك الهجرة ، والتمايز والنشاط متشابك. الخلايا النجمية الدبقية أيضا إطلاق سراح السيتوكينات وعوامل أخرى قابلة للذوبان والتي هي قادرة على التسامح على حد سواء العصبية تحفيز استجابات معاكسة في الأنسجة المحيطة العصبية ، فضلا عن تشجيع العديد من السموم. مما يدل على عمق التفاعلات العصبية - الدبقية ، وشارك في دراسات ثقافة ، وقد تبين أن الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية ضد سمية الاكسدة ، في حين لم تظهر ضعف وظائف نجمي ، مثل الصيانة للدفاع المضادة للأكسدة ، ومستويات الطاقة الخلوية ، إلى تأثير حاسم بقاء الخلايا العصبية. وقد اقترحت الدراسات الحديثة أن استخدام الخلايا النجمية في اختبار النظام في المختبر العصبية قد تكون أكثر أهمية للإنسان هيكل الجهاز العصبي المركزي وظيفة من الخلايا العصبية وحدها. على الرغم من الوعي المتزايد لأهمية الفسيولوجية العصبية ، نجمي التفاعلات ، فقد كان في السابق من الصعب إجراء تحليل الكمي لهذه التفاعلات في خلايا سليمة. ظهور فحص نسبة عالية تمكن من تطوير فحوصات جديدة وقوية لمعالجة هذا الأمر.

في هذه الدراسة ، وقد أثبتنا أن يتم إجراء تحليلات كمية من الظواهر المتعددة ونجمي الخلايا العصبية داخل مقايسة واحدة بفضل HCA. في الخلايا العصبية الأولية قد أجرينا القياسات الكمية من علامات العصبية مثل عدد الخلايا العصبية ، وطول العد neurite neurite. في الخلايا النجمية ، دباق رد الفعل هو معروف من العلامات البيولوجية العصبية ، التي تتميز التعديلات في التعبير GFAP ، وعدد نجمية ومورفولوجيا نجمية. لقد أثبتنا التي قد بسهولة كل من هذه النهاية أن تقيم عبر HCA. هذه الدراسات مفهوم الدعم التي يمكن أن تستخدم HCA من المؤشرات الحيوية العصبية محددة كجزء من مجموعة من التجارب في المختبر لفحص السريع لأعداد كبيرة من المواد الكيميائية بالنسبة لنهايات أعصاب.

وتتألف لميليبور HCS222 تحليل محتوى عال عدة للثقافة مشتركة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية من الكواشف ذات جودة عالية وبروتوكولات للالتنميط في وقت واحد ، βIII تويولين والدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) في طائفة واسعة من النماذج من العصبية الخلوية. الكواشف عالية التحقق المقدمة مع هذه المجموعة تسمح للمستخدم لتوحيد المقايسات ، والحد من مقايسة إلى مقايسة تقلباته ، وتوليد الصور بتكاثر مع نسبة إشارة إلى خلفية عالية.

الكتاب وجميع العاملين في المؤسسة ميليبور.

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. ريك ريان ، أوميش باتل ، وحتى جيف هسو ماثيو ، ميستري جيهانجير وميشيل Hatler للحصول على دعم خلال تطوير هذه المشاريع والبروتوكولات.

1. Radio, NM., Mundy, WR. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology 29, 361-376 (2008).
2. Richards, GR., Smith, AJ., Parry, F., Platts, A., Chan, GK., Leveridge, M., Kerby, JE., Simpson, PB. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
3. Evans, NA., Facci, L., Owen, DE., Soden, PE., Burbidge, SA., Prinjha, RK., Richardson, JC., Skaper, SD. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods 175, 96-103 (2008).
4. Breier, JM., Radio, NM., Mundy, WR., Shafer TJ. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
5. Radio, NM., Breier, JM., Shafer, TJ., Mundy, WR. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
6. Harry, GJ., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
7. Prockop, LD. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
8. Woehrling, EK., Hill, EJ., Coleman, MD. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro 21, 1241-1246 (2007).
9. Holden, LJ., Coleman, MD. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241:75-83 (2007).
10. Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
11. Eng, LF., Ghirnikar, RS., Lee, YL. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
12. Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
13. O'Callaghan, JP., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
14. Mead C, Pentreath VW. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
15. Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. In: Neurotoxicology In Vitro. Taylor & Francis, London, pp. 269-283 (1999).
16. Yokosuka M, Ohtani-Kaneko R, Yamashita K, Muraoka D, Kuroda Y, Watanabe C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
17. Weible II, MW., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
18. Casulari, LA., Melcangi, RC., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
19. Dringen, R., Gutterer, JM., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
20. Cristòfol, RM., Gassó, S., Vílchez, D., Pertusa, M., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).

5 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.