Proteomics om eiwitten Interactie met P2X2 ligand-gated kationenkanalen identificeren

Experimentele procedures

De experimentele procedure (figuur 2) bestaat uit vier onderdelen die hieronder worden beschreven in een stapsgewijze manier.

Deel 1: subkloneren en expressie van de C-terminus van P2X2 receptoren.

We hebben geuit over de volle lengte C-terminus van P2X2 receptoren in bacteriën naar de hersenen eiwitten waaraan het bindt identificeren.

1. De C-terminus (residuen 353-472) van de P2X2 receptor (figuur 1) werd geamplificeerd door PCR, gekloneerd in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) en geverifieerd met sequencing.
2. Het recombinante plasmide werd getransformeerd in E. Coli (BL21) voor de expressie van recombinante eiwitten.
3. Glycerol voorraden van bacteriën (E. coli BL21) met de P2X2 CT-GST plasmide werden geschraapt met een steriele pipet tip en geënt in 5 ml Luria-Bertani (LB) media met geschikte selectieve marker (50 g / ml ampicilline) en 's nachts geïncubeerd in een orbitale schudder bij 37C.
4. De kweken gedurende de nacht gekweekt werden geïnoculeerd in 250 ml van LB media met een geschikte antibioticum (50 ug / ml ampicilline) en geïncubeerd in een orbitale schudder bij 250 rpm gedurende 2-3 uur bij 37 ° C tot de optische dichtheid bij 600 nm bereikt ~ 0,6-0,7.
5. De cultuur werd geïnduceerd met 1 mM van IPTG en verder geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur voor eiwitexpressie.
6. De cultuur werd daarna gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 15 min bij 4C (1 ml van de cultuur was gered voor het analyseren van het expressieniveau en gelabeld als 'geïnduceerde'). Supernatant werd weggegooid en de pellet werd geresuspendeerd in 20 ml van Saline Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0).
7. De suspensie werd gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 15 min in een 50 ml falcon buis. Het supernatant werd verwijderd en de semi-droge pellet werd ingevroren bij-70C 's nachts.
8. De 70C-pellet werd geresuspendeerd in 40 ml ijskoud lysis buffer (2% (w / v) Sarkosyl, 15 mg lysozym, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT en complete protease remmer tablet) , en de suspensie werd geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten. Tijdens deze incubatie werden de 3 ml Glutathion-Sepharose 4B parels gewassen met 20 ml fosfaatbuffer Saline (PBS) en 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 in PBS), gevolgd door PBS. De kralen werden geresuspendeerd in 1 ml PBS.
9. De bacteriële suspensie werd bevroren en ontdooid 3 keer in vloeibare stikstof en gesoniceerd (1s aan / uit, 30 micron gedurende 3 minuten op ijs) en verder geïncubeerd gedurende 30 minuten met 4% (v / v) Triton X-100, 10 mM MgSO ₄ en 2 mM ATP op het ijs.
10. Het lysaat werd gesponnen bij 20.000 g gedurende 15 minuten bij 4C en pellet werd weggegooid (een monster van pellet en 1 ml supernatant werd bewaard voor SDS pagina kunt u de hoeveelheden eiwitten te testen in cytosol en membranen). Het supernatant werd geïncubeerd met de kralen van een uur (of 's nachts) in 4C.
11. De kralen werden gesponnen bij 500 g gedurende 5 minuten en het supernatant werd verwijderd (monster werd bewaard voor ongebonden fractie). De kralen werden gewassen met T-PBS vijf keer (wasbeurten werden opgeslagen voor wassen controles).
12. De parels werden vervolgens geresuspendeerd in PBS tot 50% (w / v) geven drijfmest en opgeslagen in de koelkast bij 4C tot gebruik. De eiwitconcentratie werd geschat door Bradford assay (per fabrikant).

Deel 2: Voorbereiding van de gehele hersenen lysaten

P2X2 receptoren is bekend dat ze overvloedig worden uitgedrukt in de hersenen ^8. In de huidige analyses hebben we getracht de eiwitten interageren met P2X2 receptoren van ratten hele brein lysaten (afb. 3) te identificeren.

1. Volwassen hersenen van de rat werd geoogst (dieren werden geofferd volgens een UCLA IAACUC-goedgekeurde protocol en volgens de NIH Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren) en gespoeld meteen ijskoud PBS (3X).
2. Om de cellen te lyseren 10 ml (~ 5 maal het natte gewicht van de geoogste hersenen) van de ijskoude lysis buffer die 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na ₃ VO _4, 1 mM PMSF, 5 ng / ml leupeptin, was 1% (v / v) NP-40, en een proteaseremmer cocktail tablet toegevoegd aan de geoogste hersenen.
3. Hersenweefsel werd gehomogeniseerd op ijs met een glas Dounce homogenisator tot een homogeen mengsel van de consistentie werd bereikt.
4. Cellysaat werd gesponnen bij 2000 g gedurende 5 minuten om de ongebroken cellen te verwijderen. Het supernatant werd verzameld en gesponnen weer bij 29.000 g gedurende 60 minuten aan intacte organellen en membraan aggregaten te verwijderen.
5. Onmiddellijk na het centrifugeren van de supernatant werd overgebracht naar een schone buis. Het eiwit concentratie van het gehele brein lysaat werd gemeten door Bradford assay (meestal ~ 15 mg / ml).
6. Het lysaat werd gealiquoteerd en opgeslagen bij-70C.

Deel 3: Isolatie van P2X2 C-staart geassocieerde eiwitten

Het identificeren van de binding partners van P2X2 CT-GST van hele brein lysaten, een pull-down test werd uitgevoerd met behulp van CT-GST geïmmobiliseerd op glutathion Sepharose 4B parels als lokaas. Voor de controles, werd GST alleen gebonden aan kralen gebruikt.

1. Brain lysaat werd precleared met GST kralen gedurende 1 uur bij 4C. De pellet werd verwijderd en het supernatant werd gebruikt voor verdere analyses.
2. Gelijke hoeveelheden van de GST en P2X2 CT-GST (10 ug) gebonden aan glutathion sepharose 4 B kralen werden gedurende de nacht geïncubeerd met 100 g precleared opgeloste eiwitten uit de rat hele brein lysaat, met rotatie in 4C in de lysis buffer.
3. Kralen werden gesponnen bij 1000 g gedurende 5 minuten en het supernatant werd weggegooid.
4. De kralen werden eenmaal gewassen met de lysis buffer en gekookt in gewijzigde Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercapto-ethanol, 2% (v / v) glycerol, 0,004% (w / v) broomfenolblauw en 0,125 M TrisCl pH 6,8] gedurende 5 minuten.
5. De monsters werden gecentrifugeerd bij 5000 g gedurende 5 minuten en het supernatant gescheiden door 10% SDS-PAGE (afb. 4). Gels werden gekleurd met SYPRO Ruby eiwitgel vlek (volgens de instructies van de fabrikant) en zichtbaar onder ultraviolet licht. P2X2 CT-geassocieerde eiwitten werden vergeleken met teruggevonden die gebruik maken van GST-null als lokaas. Vier biologische repliceert werden uitgevoerd (dat wil zeggen vier hersenen en vier onafhankelijke pull downs).

Deel 4: Identificatie van eiwitten.

Eiwitten worden gescheiden door gel-elektroforese werden uitgesneden uit de gel en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie ^12. Opmerking: afwezigheid van stof tijdens het gehele proces is van cruciaal belang voor keratine besmetting te verminderen. De experimentator moet dragen een gezichtsmasker, haar netto en handschoenen te allen tijde en nooit de gel gebied van belang contact zonder het gebruik van handschoenen.

1. Alle zichtbare eiwitbanden hersteld van de P2X2 pull-down werden uitgesneden met een schone scheermesje en in blokjes gesneden (afb. 4). Overeenkomstige regio's van de gel in het GST-null pull-down laan werden ook besneden op dezelfde manier zonder rekening te houden band vlekken (banden specifiek voor de GST-null lokaas werden ook uitgesneden en geïdentificeerd) om dat de aanwezigheid van eiwitten te verzekeren onder het niveau van vlekken gevoeligheid was niet gemist.
2. De gel stukken werden geïncubeerd met 200 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat in 50% (v / v) acetonitril (ACN) en de buizen gevortexed gedurende 15 min bij RT. Herhaal deze wasstap.
3. De gel stukken werden ontwaterd door toevoeging van 200 ul acetonitril (gel stukken moeten krimpen en worden ondoorzichtig in kleur).
4. Acetontrile werd verwijderd en de gel stukjes gedroogd in een speedvac voor ~ 10 minuten.
5. De gel stukken werden vervolgens geïncubeerd met 30 ul van de vers bereide 10 mM DTT/10 mM Tris (2-carboxy-ethyl) fosfine hydrochloride (TCEP) van voldoende volume om de stukken onder te dompelen. Dit bleef gedurende 30 min bij 56c waterbad.
6. Vervolgens wordt de DTT-oplossing werd vervangen door 100 ul 500 mM ammoniumbicarbonaat in 50% acetonitril-oplossing en de gel plakjes gewassen met ammounium bicarbonaat.
7. Het wassen oplossing werd opgezogen en 200 ul van acetonitril toegevoegd aan de gels uitdrogen.
8. Acetonitril werd vervolgens verwijderd en 100 ul vers bereide 100 mM joodacetamide oplossing werd toegevoegd aan gratis sulfhydryls alkylaat. Deze stap ging gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
9. Joodacetamide oplossing werd verwijderd en de gel stukken werden gewassen met 200 ul van 50 mM ammoniumbicarbonaat in 50% acetontrile (pH 8,0) gedurende 2 minuten, terwijl vortexen. Deze wasstap werd herhaald.
10. Na het verwijderen van de wasoplossing, werden de stukken gel geïncubeerd met 200 ul acetonitril, die vervolgens werd door speedvac verwijderd voor ~ 10min.
11. Bij deze stap de gel stukken zijn klaar voor trypsine spijsvertering. Gel stukken werden geïncubeerd in 30 ul trypsine oplossing (20 ng / ul werk concentratie) en op ijs geplaatst gedurende 10 minuten voor de gels goed te gezwollen. Overtollig trypsine werd verwijderd en gerehydrateerd gel deeltjes bedekt met 30 ul met 50 mM ammoniumbicarbonaat om ze ondergedompeld in heel de spijsvertering, die mocht voor 12 tot 16 uur te gaan op 37C.
12. Vijf ul van 5% (v / v) Mierenzuur wordt toegevoegd aan de trypsine en arrestatie spijsvertering uit te schakelen.
13. Buizen werden vortex voor ~ 15 min en gecentrifugeerd kort om de vloeistof te brengen naar de bodem van de buis, die vervolgens werd overgebracht naar een schone en gelabeld 0,5 ml flacon.
14. Volgende 30 pi van 0,1% (v / v) Mierenzuur in 50% acetonitril werd toegevoegd aan gel stukken, zodat ze waren net bedekt, gevolgd door vortexen tweemaal voor 10-15 minuten, van elkaar gescheiden door korte centrifugeren. Deze stap was een keer herhaald, ter vervanging van het mierenzuur-acetonitril tussen de stappen.
15. De laatste vloeistof werd verwijderd en alle extractie-oplossing gecombineerd in een enkele flacon. Dit volume werd teruggebracht tot ~ 30 ul in de speedvac. Het monster was nu klaar voor reverse phase nano-vloeistofchromatografie en eiwit-identificatie door massa-spectrometrie. In dit specifieke voorbeeld, is deze stap uitgevoerd op een Orbi-trap tandem massaspectrometer van ThermoFisher (gekozen voor de hoge nauwkeurigheid van massa's, snelle duty cycle voor eiwit detectie en in het algemeen robuuste operationele functies), hoewel andere modellen en fabrikanten instrumenten gemakkelijk kunnen worden gekoppeld aan de beschreven aanpak op dit punt.
16. De details en de criteria voor massaspectrometrische analyses worden nu kort voorgesteld. Alle peptiden werden gescheiden door omgekeerde fase nano-LC (Eksigent) en peptiden werden geladen op een C18 reverse-fase kolom met een debiet van 3 pl / min. Mobiele fase A was 0,1% mierenzuur en 2% ACN in water; mobiele fase B was 0,1% mierenzuur en 20% water in ACN. Peptiden werden geëlueerd uit de kolom met een debiet van 220 nl / min met behulp van een lineaire gradiënt van 5% B tot 50% B meer dan 90 min, daarna tot 95% B over 5 min, en uiteindelijk constant houden 95% B gedurende 5 minuten . Spectra werden verworven in data-afhankelijke modus met de Orbi-trap gebruikt voor MS-scans en LTQ voor MS / MS scans. Peptiden werden geïdentificeerd door te zoeken op de spectra tegen de rat BIV-database v.3.53 het gebruik van de Sequest algoritme geïntegreerd in de BioWorks softwarepakket. Elke peptide voldoet aan de volgende criteria: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (+2), ≥ 4 (+3), en DeltaCN> 0,1. Alle spectra gebruikt voor de eiwit-identificatie werden handmatig gecontroleerd en geen eiwitten geaccepteerd wanneer er minder dan twee peptiden werden geïdentificeerd. Alleen eiwitten die aanwezig zijn na elke van de vier P2X2 trekken downs en afwezig tijdens de GST-null pull downs werden beschouwd voor verdere analyse.

Figuur 1. Schematische weergave van een P2X2 receptor subeenheid. A. De cartoon illustreert de topologie van een P2X2 receptor subeenheid. De cytosolische domein bestaat uit N-en C-termini. De C-terminus van P2X2 receptor (rood) werd gebruikt als aas voor de pull-down-test. B. aminozuursequentie van de P2X2 receptor C-terminus in deze studie gebruikt.

Figuur 2. Stroomschema en de tijd lijn van het protocol wordt gebruikt voor expressie, zuivering, pull down en identificatie van eiwitten. We tonen de contouren van het protocol met de tijd lijn. Volwassen hersenen van de rat lysaat werd vers bereid vlak voor het gebruik voor de pull-down assays.

Figuur 3. Schematische weergave van de binaire proteoomanalyse van P2X2 C-terminus netwerk in de hersenen van de rat. De C-terminus van P2X2 receptoren gefuseerd met GST-eiwit gebonden aan GST kralen werd gebruikt voor het pull-down assays. Brain lysaat werd voorbereid en eiwitten werden geïncubeerd met de geïmmobiliseerde recombinante eiwitten. Niet-gebonden fractie werd gewassen met de lysis buffer. Eiwitten werden geïdentificeerd door massa-spectrometrie.

Figuur 4. Identificatie van binding partners van de C-terminus van P2X2 receptoren. Sypro gekleurde gel met een spectrum van vermeende eiwitten die interageren met de C-terminus van receptoren gefuseerd met GST (blauwe doos). Controles rijstroken voor GST alleen (geel doos) en glutathion sefarose kralen alleen worden ook getoond. De pijlen geven voorbeelden van unieke bands die waren voor verdere analyse uitgesneden door massa-spectrometrie.

Ion kanalen zijn een belangrijke klasse van integrale membraaneiwitten. Ze bevatten met water gevulde poriën die selectief toestaan ​​dat de beweging van ionen neer hun elektrochemische gradiënten het plasmamembraan. Ionkanalen hek tussen open en de gesloten staten. De gating stap wordt geactiveerd door zenders (bijv. ATP) in geval van P2X ligand gated ionkanalen, of het kan worden gereguleerd door interacties met andere eiwitten. Het laatste decennium is getuige geweest van een toename van ons begrip van hoe P2X receptoren binden ATP ^13, maar de rol van bijkomende eiwitten bij het ​​reguleren van P2X functie blijft minder goed begrepen. De aanpak beschreven in dit protocol is ontworpen om de signalering complexen gevormd door P2X2 receptoren door het onderzoeken van (als een eerste stap) de eiwitten interactie met het intracellulaire C-terminus te identificeren. Een volledige kaart van de P2X2 receptor-signalering complex zal de broodnodige inzicht in de pathofysiologie van deze fascinerende kanalen.