Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

, , ,

McLean Hospital, Harvard Medical School

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.180.187, User IP: 54.234.180.187, User IP Hex: 921351355

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

Abstract: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

ЭС клетки обладают потенциалом дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков, что делает их привлекательным инструментом для разработки новых методов лечения. В общем, дифференцировку ЭС клетки придерживается концепции сначала подготовить незрелых клеток-предшественников, которые затем могут быть распространены и дифференцировались в зрелых клеточных фенотипов. Это относится и к ЭСК полученных нейрогенез, в котором развитие нервных клеток является продолжением двух основных этапов: Во-первых, вывод и расширения незрелых нейроэпителиальных прекурсоров и во-вторых, дифференциация их в зрелые нервные клетки. Распространенным методом для производства нейронных прародителей из ЭС клеток основана на эмбриоидных тела (EB) образование, которое показывает, дифференцировки клеток от всех зародышевых листков в том числе нейроэктодермы. Альтернативный и более эффективный метод, чтобы побудить нейроэпителиальных развития клетка использует стромальных клеток-производных вызывающие активность (SDIA), которая может быть достигнута путем совместного культивирования ЭС клетки и черепа костномозгового происхождения стромальных клеток (1). Оба, Е. Б. формирования и SDIA, показывают развитие розетка-подобных структур, которые, как считается, напоминают нервной трубки и / или нервного гребня, как прародителей. Нейронных прекурсоров может быть изолирован, расширение и дальнейшее дифференцировались в специфических нейронов и глии клеток с использованием определенных условиях культуры. Здесь мы описываем поколения и изоляции таких розетки во взаимодействии культуры эксперименты с стромальных клеточных линий MS5 (2-5).

Protocol: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Шаг 1

  1. Пластина митомицин-С ggrowth-тормозится (10 мкг / мл в течение 2,5 часов) MS5 клеток при плотности 70000 / см2 на желатин покрытием (0,01% в течение 30 минут) 6 луночных планшетах в α-MEM СМИ.
  2. Когда клетки прикрепляются и образовали монослоя (за одну ночь роста), переключиться на SRM.
  3. Вручную изолировать колонии ЭСК из ES культурах клеток с помощью шприца с 27 ½ G иглы.
  4. Tritrurate колонии тщательно с 1 мл синий наконечник и пластины при низкой плотности на MS5 клетки (обычно 2-3 колоний на 6-луночный планшет).

Примечание: ЭС клетки могут быть взяты из ферментативных распространения с применением коллагеназы или трипсина.

Шаг 2

  1. Расти ЭС клеток на MS5 питателей в течение 14-21 дней, пока розетки содержащих образуют колонии.


Примечание: Изменение СМИ часто. Розетки, как правило, на внешних краях колоний и их образование может быть значительно повышена, если 300-500 нг / мл Ноггин добавляется в SRM (3). В некоторых дифференциация протоколы, SRM можно обменять на N2-медиа и дополнены роста или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Шаг 3

  1. Изолировать и подобрать розетки с 27 ½ G иглу под микроскопом.

Примечание: Не резки и выбрать MS5 стромальных клеток. Если колонии упакованы с розетками, можно также выделить всю колонию.


Шаг 4

  1. Аспирируйте кластеров розетки, tritrurate их тщательно с 1 мл синий наконечник, и пластины их на поли-L-орнитин (0,001%) и фибронектина (1 мкг / мл) или ламинин (1 мкг / мл) покрытием 6 скважин в N2-СМИ обычно дополнены bFGF (20 нг / мл). Розетки будут реформировать и расширить.

Примечание: Для повышения выживаемости клеток, можно пластины малых кластеров в каплях увеличить плотность клеток. Этот шаг также может быть изменена путем дополнения N 2-СМИ с дополнительным ростом или другие факторы, чтобы способствовать ячейки спецификации (2-5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Этот протокол демонстрирует различные этапы в создании и изоляции нейроэпителиальных клеток из человеческих клеток ES использованием SDIA. Применение этого метода состоит в многообразии и была использована во многих протоколов для производства указанных нейронов (например, 1, 2, 5-9). Розетки, как полагают, напоминают нервные клетки трубки с передней фенотип (2, 5, 10), а также содержат нейронных прародителей гребне (11, 12). Кроме того, они сохраняют определенный уровень пластичности, так как они могут быть составлены по образцу конкретных факторов в определенных условиях культуры. Таким образом, SDIA полученных нейронных прародителей может дать начало многим типам клеток из центральной и периферической нервной системы делает их полезным инструментом для вывода различных нервных клеточных популяций в парадигмах ES клеточной дифференцировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Materials: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

Name Type Company Catalog Number Comments
L-glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
alpha-MEM GIBCO, by Life Technologies 12571
penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Knockout-DMEM GIBCO, by Life Technologies 10829
Knockout serum replacement GIBCO, by Life Technologies 10828
MEM non-essential amino acid solution GIBCO, by Life Technologies 12383
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11330
N2-A supplement Stem Cell Technologies 07152
mitomycin-C Sigma-Aldrich M0503
gelatine type-A Sigma-Aldrich G1890
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957 0.01 % solution
laminin Sigma-Aldrich L-2020
fibronectin Sigma-Aldrich F2006
basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen 13256
1 ml syringe with 27 1/2 G needle BD Biosciences 309623
N2-A media medium DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium Knockout-DMEM + 20 % Knockout serum replacement +1% MEM non-essential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium α-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-glutamine + 1%penicillin/streptomycin
MS5 cell line stromal cells
Microscope
6 well plates for tissue culture

References: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

1. Kawasaki, H. et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 28, 31-40 (2000).

2. Perrier, A.L. et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12543-12548 (2004).

3. Pruszak, J. & Isacson, O. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. (eds.); John Wiley & Sons (2007).

4. Pruszak, J., Sonntag, K.C., Aung, M.H., Sanchez-Pernaute, R. & Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells 25, 2257-2268 (2007).

5. Sonntag, K.C. et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells 25, 411-418 (2007).

6. Kawasaki, H. et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 1580-1585 (2002).

7. Ko, J.Y. et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem 103, 1417-1429 (2007).

8. Hong, S., Kang, U.J., Isacson, O. & Kim, K.S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem (2007).

9. Zhang, S.C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol 16, 132-142 (2006).

10. Pankratz, M.T. et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells 25, 1511-1520 (2007).

11. Lazzari, G. et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells 24, 2514-2521 (2006).

12. Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B. & Goldstein, R.S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells 23, 923-930 (2005).

Ask the Author: ES Cell-производные нейроэпителиальных клеточных культур

1 Comment

Where can we get MS5 stromal cell line?

Sergey Akimov, JHU SOM

1

Reply

Posted by: Sergey A.June 24, 2010, 12:00 PM

Just now noticed your comment. I believe the easiest way to obtain MS5 cells is via DSMZ - (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; http://www.dsmz.de). The MS5 line is internal DSMZ no."ACC 441".

1.1

Reply

Posted by: Jan Pruszak, University of Freiburg, GermanyOctober 27, 2011, 8:32 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter